核磁共振儀上進行的，以便獲取更加確切 的細節(jié)信息，同時也對初步測試的結(jié)果進行證實。通過對所得 1H-NMR和13C-NMR譜圖（見 圖4a~h)進行細致分析，可以看出，除了由于生成羧酸鈉鹽所引起的化學位移變化以外， 鈉鹽的結(jié)構(gòu)相對于酸來說，沒有發(fā)生變化。最顯著的能夠支持鹽生成的化學位移的變化在 于：
[0144] a.積雪草酸的1H-NMR譜圖中，在11. 9ppm的位置有一個氫的信號，通常對應(yīng)羧基 中的氫。而在其鈉鹽的譜圖中沒有該信號。
[0145] b.在13C-NMR譜圖中，羧基中碳原子的信號也發(fā)生了變化，這種變化可以用鹽的生 成來解釋。
[0146] D. X-射線粉末衍射
[0147] X-射線衍射實驗所用儀器為Shimadzu Lab X，，XRD-6000,測試標準參見：美國藥 典（USP)〈941〉。圖5a為積雪草酸的衍射圖，圖中的寬峰為非晶體的特征峰。而按照前文 IV . A. 3中所述的方法，將鈉鹽的制備規(guī)模放大到2g，通過HPLC分析，獲得如前述IV . B中的 結(jié)果，并且該鈉鹽的X-射線粉末衍射譜圖與晶體的特征一致（參見圖5b)。
[0148] E.傅立葉變換紅外光譜圖
[0149] 將積雪草酸、積雪草酸鈉鹽（AJF09, 82和AJF09, 99b)和積雪草酸銨鹽 (AJF09, 99a)進行傅立葉變換紅外光譜測試。圖6為所得到的積雪草酸的紅外光譜圖，其中 1697cm 1附近的峰為典型的羧酸特征峰。
[0150] 鈉鹽AJF09, 82 (圖7)和AJF09, 99b (圖8)的紅外譜圖清楚地顯示了 1697cm 1附 近羧酸特征峰的強度的減弱，以及1545cm1和1390cm 1附近峰的出現(xiàn)。產(chǎn)生這種變化的原 因在于與羧酸基團不同的羧酸鹽基團的存在。這是支持積雪草酸鹽生成的光譜學證據(jù)。銨 鹽（AJF09, 99a)的紅外譜圖（圖9)中存在1390cm 1附近的特征峰，同樣證實了羧酸鹽的存 在，該圖中1690cm 1附近還存在羧酸的特征峰，這是由于從酸到鹽轉(zhuǎn)化不完全所造成的。
[0151] R熱重分析（TGA)
[0152] 本發(fā)明中的TGA在Q5000型熱分析儀上進行。儀器的校準參照美國藥典（USP) 〈891〉，用鎳標樣進行。將積雪草酸和兩種鈉鹽AJF09, 82和AJF09, 99b進行熱重分析（實 驗結(jié)果見圖10~12)。從圖中可以看出，積雪草酸在400°C開始分解，而兩種鈉鹽則顯示了 較佳的耐熱性，這種現(xiàn)象在生成鹽的變化中是比較常見的。
[0153] G.鈉含量的測定
[0154] 測定鈉含量所用儀器為Perkin Elmer AAnalyst 300型原子吸收分光光度計，其 中裝有HGA 850型石墨爐，使用氧化空氣一乙炔火焰，在波長為589nm處進行檢測。通過 1000mg/L的氯化鈉溶液配制鈉的標準溶液。用本方法測定鈉含量時，通常在堿金屬（如銫） 的存在下進行，以便控制離子化的程度。因此，應(yīng)首先用實驗來確定銫（以氯化銫的形式存 在）的用量，這對于提高儀器對鈉的敏感度非常必要。經(jīng)實驗確定，將0.3%的氯化銫用于 本發(fā)明的所有樣品和標準品。
[0155] 標準氯化鈉溶液I (1000 ppm Na)
[0156] 將精確稱重的2. 53g氯化鈉置于1.0 L的容量瓶中，加適量去離子水使其全部溶 解，再用去離子水稀釋至刻度，即得所需氯化鈉標準溶液。
[0157] 3 %的氯化銫溶液
[0158] 將精確稱重的3g氯化銫置于IOOmL的容量瓶中，加適量去離子水使其全部溶解， 再用去離子水稀釋至刻度，即得所需氯化銫溶液。
[0159] 0· 3 %的氯化銫溶液（稀溶液）
[0160] 將精確稱重的6g氯化銫置于2. OL的容量瓶中，加適量去離子水使其全部溶解，再 用去離子水稀釋至刻度，即得所需濃度的氯化銫溶液。
[0161] 稀釋液1 (含IOOppm Na的0· 3%的氯化銫溶液）
[0162] 將10.0 ml標準氯化鈉溶液I (1000 ppm Na)和10.0 ml濃度為3%的氯化銫溶液移 至100mL容量瓶中，再用去離子水稀釋至刻度。
[0163] 稀釋液2 (含IOppm Na的0· 3 %的氯化銫溶液）
[0164] 將10.0 ml稀釋液1 (含IOOppm Na的0· 3%的氯化銫溶液）轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶 中，用0. 3%的氯化銫溶液（稀溶液）稀釋至刻度。
[0165] 系統(tǒng)響應(yīng)的線性
[0166] 測試系統(tǒng)的線性是指在一定范圍內(nèi)，該系統(tǒng)能夠給出與測試樣品的濃度成比例的 測試結(jié)果的特性。本發(fā)明中首先測定了吸光度和鈉濃度的關(guān)系。在測試前，先配制好氯化納 標準溶液，配制過程如下：分別精確轉(zhuǎn)移2. 0ml、3. 0ml、4. 0ml、5. Oml和6. Oml稀釋液2(含 IOppm Na的0. 3%的氯化銫溶液）至5個獨立的50ml容量瓶中，用0. 3%的氯化銫溶液分 別稀釋至刻度，從而制得濃度分別為〇· 4ppm、0. 6ppm、0. 8ppm、1.0 ppm和I. 2ppm的標準溶 液。在測試中，每種濃度的樣品讀數(shù)3次，以其讀數(shù)的平均值作為該濃度的吸光度。以樣品 的吸光度對其濃度作圖，即可得到線性曲線（圖13)。
[0167] 積雪草酸鈉鹽AJF09, 82和AJF09, 99b的測試結(jié)果如表3所示
[0168] 表3.積雪草酸鹽中鈉的含量
[0170] 如果假定每個積雪草酸鹽分子對應(yīng)一個鈉離子，那么樣品中鈉的含量應(yīng)該為 4. 5%〇
[0171] 實施例2所得產(chǎn)物的動物實驗結(jié)果
[0172] 對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化的影響
[0173] 1.目的
[0174] 為了觀察積雪草酸和積雪草苷對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化的影響，分別在疾 病動物模型建立以后的第二天和第七天給藥。
[0175] 2.材料和方法
[0176] 動物：SD大鼠（雄性），體重250~300g，由上海SLACC有限公司提供；
[0177] TFG-β Kit，人 96T ELISA Kit 購自上海晶美；
[0178] TNF-a Kit，人 96T ELISA Kit 購自上海晶美；
[0179] 積雪草苷（純度彡92% );
[0180] 積雪草酸（純度> 98% )
[0181] 注射用博萊霉素，規(guī)格：8mg/Ap，由天津太河制藥有限公司提供；
[0182] 地塞米松，規(guī)格：5mg/Ap，由上海信誼藥業(yè)提供。
[0183] 3.劑量和給藥途徑
[0184] 積雪草酸 3、9和27mg/kg 口服（p.o.) X28天 積雪草苷 36 mg/kg p.o. X 28人 地塞米松 0.6 mg/kg p.o. X 28天 博萊霉素 5'mg/kg: .P:. ο... .X 2:8:天
[0185] 4.方法
[0186] 雄性SD大鼠，體重250~300g，用3%的西可巴比妥麻醉后，平放，固定在手術(shù)臺 上。將其頸部用乙醇消毒，切開，露出氣管。將注射針插入氣管環(huán)之間的空隙中，注入5mg/ kg博萊霉素。保持大鼠堅立、旋轉(zhuǎn)，使溶液均勻分散在肺中。縫合切口。
[0187] 待大鼠恢復意識后，隨機分成兩組：（i )動物模型建立后的第二天接受施藥； (ii)動物模型建立后七天接受施藥。兩組中再分成以下各小組：27、9和3mg/kg p.o. X28 天積雪草酸組；0.611^/1^?.〇.\28天地塞米松組；3611^/1^?.〇.\28天積雪草苷組；模型 組和空白組。對模型組和空白組施用生理鹽水。在施用積雪草酸和積雪草苷后第28天，計 算大鼠的存活率以及肺的重量占體重的百分比，并進行病理檢查和血清檢查。
[0188] 表4.試驗第7-28天大鼠的死亡率
[0191] 積雪草酸處理對博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠肺重指數(shù)的影響
[0192] 大鼠的體重和肺重在其死后測定。
[0193] 肺重比=(肺的重量/體重）X 100%
[0194] 結(jié)果見表5和表6。在下表中，一顆星（*)表示和模型組相比區(qū)別較明顯 (Ρ〈0·05);兩顆星（#)表示區(qū)別非常明顯（Ρ〈0·01)
[0195] 表5.積雪草酸給藥28天后的肺重指數(shù)（模型建立后第二天開始給藥）
[0196]
[0199] 如表5和表6所示，建模后第二天或第七天開始給藥的高、中、低劑量積雪草酸組 的大鼠的肺重指數(shù)均明顯低于模型組。積雪草苷組的實驗結(jié)果與積雪草酸組類似。地塞 米松組的肺重指數(shù)相對較高，很可能是由于地塞米松引起的體重降低造成的。
[0200] 積雪草酸處理對于博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠的細胞因子的血清學影響
[0201] 按照標準操作程序制備血清樣本（樣本采集后3000rpm離心10分鐘），儲存 于-20°C。按照試劑盒上的說明進行測試，結(jié)果見表7。
[0202] 表7.積雪草酸的血清試驗結(jié)果
[0203]
[0204] 積雪草酸對博萊霉素誘導肺纖維化大鼠的影響的病理分析
[0205] 肺組織在10%的福爾馬林溶液中固定一周，其下葉經(jīng)脫水和浸蠟后，進行石蠟包 埋和切片，切片厚度為3~4μπι。再進行常規(guī)的蘇木精一伊紅（HE)染色。進行膠原纖維和 彈性纖維雙重特殊染色，以便確定纖維化的程度。觀察兩組切片的染色狀況，結(jié)果如下。
[0206] 組1 (博萊霉素建模后第二天開始給藥）
[0207] 空白組
[0208] 動物肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，沒有出現(xiàn)出血、增生或水腫的現(xiàn)象。然而，在大多數(shù)動 物的肺組織中存在炎癥細胞的浸潤。在一些動物中情況比較嚴重并伴隨局部充血。
[0209] 膠原纖維和