一種鑒別8種動(dòng)物源性成分的pcr引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肉及肉類產(chǎn)制品中動(dòng)物源性成分鑒定的食品檢驗(yàn)技術(shù)，具體涉及一種 同步檢測(cè)山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛 8種動(dòng)物源性成分的PCR方法，試劑盒 及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自古以來(lái)"民以食為天"，"食"是生存之本，也是人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚囊徊?分。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肉類及其制品成為人們?nèi)粘Ｊ澄锏闹匾獊?lái)源和組成部分。鑒于 肉類及其產(chǎn)制品的價(jià)格和利潤(rùn)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上肉食品摻假以及"掛羊頭賣狗肉"事件時(shí)有發(fā) 生，"假牛肉事件"和"馬肉風(fēng)波"等食品問(wèn)題不僅損害了消費(fèi)者的利益，同時(shí)帶來(lái)諸多社會(huì) 問(wèn)題。如今，食品種類更加豐富多樣，一部分加工食品改變了外觀和氣味，難以憑感官區(qū)分 其來(lái)源；與之同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)銷售和監(jiān)管不足都給摻假者帶來(lái)了可乘之機(jī)。打擊食品犯罪是國(guó)家 食品安全和法制的需要，國(guó)家監(jiān)管部門先后頒布多項(xiàng)法律法規(guī)來(lái)規(guī)范動(dòng)物性食品加工銷售 的多個(gè)環(huán)節(jié)。在技術(shù)上也制定了一系列的標(biāo)準(zhǔn)方法用于牛、羊、豬等物種成分的檢測(cè)，這對(duì) 打擊肉類及產(chǎn)制品摻假犯罪起到了一定作用。
[0003] 早期肉類鑒別依賴于感官和形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，這些檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確性低、局限度大，尤其 對(duì)于深加工的肉類以及飼料中添加的動(dòng)物源性成分基本無(wú)法鑒別。隨后發(fā)展起來(lái)的肉類形 態(tài)學(xué)分析和成分鑒定方法，在這個(gè)過(guò)程中基本確立了以特征性的蛋白和核酸作為靶標(biāo)物質(zhì) 進(jìn)行檢驗(yàn)的思路，如今形成了蛋白檢驗(yàn)和DNA分析兩個(gè)不同的檢測(cè)方向。經(jīng)過(guò)20多年的發(fā) 展，兩種鑒別技術(shù)在精度和靈敏度均有極大提高。但是當(dāng)肉類經(jīng)過(guò)物理處理如切碎、混合、 腌制、蒸煮和熏烤等過(guò)程后失去了原有形態(tài)和質(zhì)地，蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)很難滿足對(duì)這些樣品 檢測(cè)的需要。而DNA尤其是線粒體DNA(mtDNA)具有耐熱性強(qiáng)、不依賴于細(xì)胞形態(tài)、種間多 態(tài)性好等特點(diǎn)，表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確度和精度以及重復(fù)性，成為現(xiàn)代物種溯源鑒定的"DNA條 形碼"。國(guó)內(nèi)外目前在行的一系列對(duì)于動(dòng)物源性鑒定如豬、牛、羊、兔、馬、驢、狗和鹿成分的 鑒定均采用了 DNA檢測(cè)技術(shù)。但另一方面，大部分現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)對(duì)象為單一物種，對(duì) 于未知物種難以檢測(cè)，大部分方法基于熒光定量PCR技術(shù)，存在對(duì)儀器要求高、試劑相對(duì)價(jià) 格高等不足，對(duì)大批量樣品進(jìn)行篩選的成本高、耗時(shí)長(zhǎng)。因此，建立一種簡(jiǎn)便易行且可以同 時(shí)鑒定多種肉用動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足，對(duì)于提高檢測(cè)工作效 率以及未知?jiǎng)游镌葱猿煞值乃菰囱绣扯季哂兄匾饬x。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有物種鑒定技術(shù)中檢測(cè)物種單一而多重PCR技術(shù)又存在特異性差的 不足，本發(fā)明提供了一種能在一次PCR操作中鑒別8種動(dòng)物源性成分的PCR引物及試劑盒， 從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)對(duì)山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛8個(gè)物種及常見動(dòng)物（包 括雞、鴨、鼠、兔、狗、馬、驢、魚類）的mtDNA全序列做精細(xì)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了這些物種中一段特有 的變異序列及兩端的保守序列，因此以包含8個(gè)物種特異性序列兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物， 擴(kuò)增產(chǎn)物在不同物種間大小不同，因此可以用于物種的鑒定，從而促成了本發(fā)明。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種PCR引物，包括上游引物和下游引物，其信息如下：
[0007] 上游引物：CCTCCCTAAGACTCAGGGAA SEQ ID ΝΟ:1、
[0008] 下游引物：AAGCTCGTGATCTAATG SEQ ID NO:2 ;
[0009] 本發(fā)明還提供一種試劑盒，該試劑盒使用上述的引物；
[0010] 試劑盒，還包括下列試劑：
[0011] PCR A液：含有PCR反應(yīng)體系中合適濃度的PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、 引物SEQ ID 1、引物SEQ ID 2和雙蒸水；
[0012] PCR B液：含有陽(yáng)性DNA模板，包括山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝、牦牛的基 因組DNA。
[0013] 本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)鑒別8種動(dòng)物源性成分的PCR方法，其特征在于，包括 以下步驟：
[0014] 1)采集山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝、牦牛和其他常見肉類動(dòng)物組織作為建 立方法的標(biāo)準(zhǔn)品，按照動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒操作提取基因組DNA，或者參照分子 克隆的DNA提取方法，從組織樣品中獲得DNA，溶于TE溶液或純水中保存?zhèn)溆茫?br>[0015] 2)將待測(cè)樣品進(jìn)行DNA提取后用引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，依據(jù)PCR產(chǎn)物 條帶大小和有無(wú)即可判定檢測(cè)樣品中是否含有上述動(dòng)物源性成分；
[0016] 在檢測(cè)樣品是否含有上述動(dòng)物源性成分的同時(shí)應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照組；
[0017] 3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)和結(jié)果判定，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照組任何 一種存在一致性電泳結(jié)果則認(rèn)為含有對(duì)應(yīng)物種的源性成分，依次類推；
[0018] 其中，？0?反應(yīng)程序?yàn)椋?5°〇變性51^11;95°〇變性3〇8,58.5°〇退火3〇8,72°〇延伸 30s為一個(gè)循環(huán)，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；然后72°C保持lOmin，結(jié)束后降溫至4°C ;
[0019] PCR反應(yīng)中設(shè)置的陽(yáng)性對(duì)照為完好的山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝、牦?；?因組DNA樣品，陰性對(duì)照為雙蒸水。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以在一次PCR反應(yīng)中鑒定山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、 鹿、駱駝和牦牛8個(gè)物種，且具有較高的特異性和靈敏度。相對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)大大提高了檢 測(cè)效率，尤其對(duì)于未知物種成分的產(chǎn)制品溯源檢測(cè)具有重要意義。相比更為復(fù)雜的多重PCR 技術(shù)，本發(fā)明在一定程度上提高了靈敏度，更為重要的是一次PCR就可以鑒定8個(gè)物種，超 過(guò)了很多多重PCR檢測(cè)物種的數(shù)量。本發(fā)明基于PCR技術(shù)平臺(tái)，適于大多數(shù)檢測(cè)和研宄單 位應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是本發(fā)明對(duì)山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛的DNA樣品的PCR擴(kuò)增 電泳檢測(cè)結(jié)果。圖中所示為泳道編號(hào)1-8和對(duì)應(yīng)產(chǎn)物大?。ǖ诙袛?shù)字是對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物大 小，單位bp) :1 :山羊；2:綿羊；3 :鹿；4 :水牛；5 :家牛；6 :牦牛；7 :豬；8 :駱駝。參照分子 量標(biāo)注依次是 1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp*100bp。
[0022] 圖2是本發(fā)明對(duì)8種動(dòng)物DNA樣品PCR產(chǎn)物SspI酶切鑒定的檢測(cè)結(jié)果。圖中各泳 道標(biāo)注了物種名稱，其酶切后對(duì)應(yīng)產(chǎn)物片段大小如下：山羊：258bp、192bp、160bp和118bp ; 綿羊：300bp、180bp 和 75bp ;鹿：358bp 和 146bp ;水牛：453bp ;家牛：270bp 和 178bp ;耗牛： 181bp、178bp 和 73bp ;豬：300bp 和 96bp ;駱駝：326bp。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法過(guò)程做進(jìn)一步說(shuō)明。但實(shí)例僅限于說(shuō)明，并不限 于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克 (Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn) 行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù) 和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。
[0024] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)
[0025] 根據(jù)GenBank所公布的基因序列，以山羊（⑶229278)、鹿（HQ191428)、水牛 (AF702618)、牛（EU177861)、綿羊（KF938337)、牦牛（KM233416)、豬（AF486867)和駱駝 (AP003423)的mtDNA全序列為模板，通過(guò)比對(duì)分析8個(gè)物種和常見物種（雞、鴨、兔、鼠、馬、 狗）的mtDNA序列，根據(jù)其基因序列的特異性和保守性，利用Primer premier 5.0軟件，設(shè) 計(jì)多個(gè)物種的通用引物，該引物與上述山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛8個(gè)物種 的mtDNA序列配對(duì)。而且，為了提高引物檢測(cè)的靈敏度，對(duì)上游引物的序列進(jìn)行了改造。具 體的引物序列如下表1所示。
[0026] 表1 :本發(fā)明中的引物及序列
[0028] 實(shí)施例2 PCR體系優(yōu)化
[0029] PCR反應(yīng)體系采用了 20 μ L的基礎(chǔ)體系，其中緩沖液2.0 μ L，引物SEQ ID 1(或 SEQ ID 3 或 SEQ ID 4)和 SEQ ID 2 各 2.0 μ L，dNTP 1.6 μ L，Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L， MgCl2L 2 μ L，DNA 模板 3· 0 μ L (約含 30ng DNA)，ddH20 補(bǔ)充至 20. 0 μ L。
[0030] 根據(jù)上述PCR體系，在梯度PCR儀上設(shè)置溫度梯度進(jìn)行退火溫度優(yōu)化（溫度范圍 48. 0~63. 0°C)?；镜腜CR過(guò)程如下：95°C變性5min ;95°C變性40s，不同退火溫度30s， 72°C延伸40s為一個(gè)循環(huán)，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。
[0031] 不同溫度下的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)（4S Red瓊脂糖核酸染料）后選取電泳條帶大 小