一種鑒別鯉魚品種的分子標(biāo)記及利用其進(jìn)行鑒別的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒別鯉魚品種的分子標(biāo)記及利用其進(jìn)行鑒別的方法，屬于分子標(biāo) 記技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鯉魚是我國最主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，養(yǎng)殖品種眾多，目前已獲得水產(chǎn)新品種 證書的鯉魚品種就多達(dá)20多種。在區(qū)分不同鯉魚品種的時候，往往是根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，如 體色或是體長、體高、側(cè)線鱗、鰭條等可數(shù)性狀和可量性狀進(jìn)行鑒別，但這些表型性狀的數(shù) 值，在不同的鯉魚品種中都有部分重疊，以至于無法準(zhǔn)確地判別不同品種。
[0003] 分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水 平遺傳多態(tài)性的直接的反映。其中，目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（target region amplified polymorphism, TRAP)也叫革E位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性，是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)。 TRAP技術(shù)是利用生物信息學(xué)工具和表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫信息，通過對目標(biāo)候選基因區(qū)域的 PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生圍繞目標(biāo)候選基因序列的多態(tài)性標(biāo)記。是一種與性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服形態(tài)學(xué)特征無法準(zhǔn)確鑒別鯉魚品種的不足，提供一種TRAP 分子標(biāo)記及其獲得方法，有助于快速、準(zhǔn)確鑒別福瑞鯉與其原始親本一一建鯉和黃河鯉，在 鯉魚選育、種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)和利用中有極大的應(yīng)用價值。
[0005] 按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種鑒別鯉魚品種的分子標(biāo)記，采用的引物對為： 核苷酸序列為5' -3' ；固定引物序列為：5' -GCCGACTTGAAAATGG-3'，隨機(jī)引物序列為： 5' -GGAACCAAACACATGAAGA-3'。
[0006] 采用所述分子標(biāo)記進(jìn)行鯉魚品種鑒別的方法，步驟為：
[0007] (1)設(shè)計TRAP分子標(biāo)記引物：設(shè)計固定引物序列和隨機(jī)引物序列；
[0008] (2)?0?反應(yīng)：總體積為15以1^，其中]\%2+1.5臟〇1/1、(1階1^0.35臟〇1/1、隨機(jī)引物 6pmol/L、固定引物10pm 〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶1.0U，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足 體積；
[0009] PCR 反應(yīng)條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環(huán)；94°C 45s， 53°C 45s，72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C IOmin ;
[0010] (3)電泳：對步驟（3)的所得PCR產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為8. 0%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行 電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果；
[0011] ⑷結(jié)果觀察：針對特定鯉魚品種電泳后樣品出現(xiàn)電泳條帶，用于鯉品種鑒另I」、保 種和分子輔助選擇育種。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的引物對在針對福瑞鯉樣本中，擴(kuò)增出一條 200bp左右的明顯特異條帶，而原始親本建鯉和黃河鯉中并無此條帶，通過該分子標(biāo)記可廣 泛用于鯉魚品種鑒別、保種和分子輔助選擇育種。
【附圖說明】
[0013] 圖1是實施例1福瑞鯉的特異TRAP標(biāo)記示意圖（箭頭所示）。
[0014] 圖2是實施例2福瑞鯉的特異TRAP標(biāo)記示意圖（箭頭所示）。
[0015] 圖3是實施例3福瑞鯉的特異TRAP標(biāo)記示意圖（箭頭所示）。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0017] 實施例1
[0018] 福瑞鯉及其原始親本一一建鯉和黃河鯉均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研宄院淡水漁業(yè)研 宄中心宜興實驗基地，每種魚隨機(jī)各取10尾。剪取每尾魚的鰭條抽提基因組DNA。
[0019] 選擇可能與鯉魚生長性狀相關(guān)的GH(GenBank accession no. M27000. 1)， GHR(AY741100. 1)，IGF(D83272. 1)，TRH(AB179818. l)and GTH(X56497. 1)基因作為目標(biāo)候 選基因，設(shè)計18個固定引物。針對外顯子或內(nèi)含子的特點，設(shè)計了 4個富含GC或AT核心 區(qū)的隨機(jī)引物，依據(jù)Hu(2006)文獻(xiàn)設(shè)計合成。具體如表1所示。
[0020] 以所取基因組DNA為模板，用18個固定引物分別與4個隨機(jī)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，引物具體如表1所示。
[0021] PCR 反應(yīng)總體積為 15 yL，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、隨機(jī)引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。 PCR 反應(yīng)條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環(huán)；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0022] PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染 色后，拍照記錄電泳結(jié)果。
[0023] 當(dāng)用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和隨機(jī)引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)進(jìn)行擴(kuò)增時，在福瑞鯉中均出現(xiàn)一個約200bp的擴(kuò)增條帶，而建 鯉和黃河鯉中沒有這一條帶。根據(jù)這一特異性的TRAP條帶標(biāo)記，將福瑞鯉與原始親本建 鯉、黃河鯉區(qū)分出來，具體如圖1所示。
[0024] 實施例2
[0025] 福瑞鯉及其原始親本之一--建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)研宄院淡水漁業(yè)研宄中心 南泉實驗基地，另一原始親本一一黃河鯉均取自河南鄭州黃河鯉魚良種場，每種魚隨機(jī)各 取10尾。剪取每尾魚的鰭條抽提基因組DNA。
[0026] 以所取基因組DNA為模板，用18個固定引物分別與4個隨機(jī)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，引物具體如表1所示。
[0027] PCR 反應(yīng)總體積為 15 yL，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、隨機(jī)引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。 PCR 反應(yīng)條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環(huán)；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C 10min。
[0028] PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染 色后，拍照記錄電泳結(jié)果。
[0029] 當(dāng)用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和隨機(jī)引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)進(jìn)行擴(kuò)增時，在福瑞鯉中均出現(xiàn)一個約200bp的擴(kuò)增條帶，而建 鯉和黃河鯉中沒有這一條帶。根據(jù)這一特異性的TRAP條帶標(biāo)記，將福瑞鯉與原始親本建 鯉、黃河鯉區(qū)分出來，如圖2所示。
[0030] 實施例3
[0031] 福瑞鯉10尾及其原始親本--建鯉和黃河鯉各7尾均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研宄院 長江水產(chǎn)研宄所。剪取每尾魚的鰭條抽提基因組DNA。
[0032] 以所取基因組DNA為模板，用18個固定引物分別與4個隨機(jī)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，引物具體如表1所示。
[0033] PCR反應(yīng)總體積為 15 μ 1，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、隨機(jī)引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。 PCR 反應(yīng)條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環(huán)；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0034] PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染 色后，拍照記錄電泳結(jié)果。
[0035] 當(dāng)用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和隨機(jī)引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)進(jìn)行擴(kuò)增時，在福瑞鯉中均出現(xiàn)一個約200bp的擴(kuò)增條帶，而建 鯉和黃河鯉中沒有這一條帶。根據(jù)這一特異性的TRAP條帶標(biāo)記，將福瑞鯉與原始親本建 鯉、黃河鯉區(qū)分出來，如圖3所示。
[0036] 表1固定引物及隨機(jī)引物序列
[0037]
[0038]
【主權(quán)項】
1. 一種鑒別鯉魚品種的分子標(biāo)記，其特征是采用的引物對為：核苷酸序列為5' -3'；固 定引物序列為：5 ' -GCCGACTTGAAAATGG-3 '，隨機(jī)引物序列為：5 ' -GGAACCAAACACATGAAGA-3 '。2. 采用權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記進(jìn)行鯉魚品種鑒別的方法，其特征是步驟為： (1) 設(shè)計TRAP分子標(biāo)記引物：設(shè)計固定引物序列和隨機(jī)引物序列； (2) PCR 反應(yīng)：總體積為 15 y L，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPs 0. 35mmol/L、隨機(jī)引物 6pmol/L、固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶1.0U，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足 體積； PCR 反應(yīng)條件為：94 °C 4min ;94 °C 45s，35 °C 45s，72 °C lmin，5 個循環(huán)；94 °C 45s， 53°C 45s，72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C IOmin ; (3) 電泳：對步驟（3)的所得PCR產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為8.0%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳 分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果； (4) 結(jié)果觀察：針對特定鯉魚品種電泳后樣品出現(xiàn)電泳條帶，用于鯉品種鑒別、保種和 分子輔助選擇育種。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別鯉魚品種的分子標(biāo)記及利用其進(jìn)行鑒別的方法，屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。其提供一固定引物序列和一隨機(jī)引物序列，并通過這對引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳后得到結(jié)果。本發(fā)明提供的引物對只在福瑞鯉樣本中，擴(kuò)增出一條200bp左右的明顯特異條帶，而原始親本建鯉和黃河鯉中并無此條帶?？赏ㄟ^分子標(biāo)記用于鯉魚品種鑒別、保種和分子輔助選擇育種。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104946787
【申請?zhí)枴緾N201510436129
【發(fā)明人】董在杰, 曲疆奇, 朱文彬, 王蘭梅
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月22日