一種微小反應(yīng)體系水平上的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種微小反應(yīng)體系水平上的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種用于核酸快速擴(kuò)增的新技術(shù)，具有快速簡便、容易普及、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)；尤其在靈敏度、特異性和反應(yīng)時(shí)間上更具有無語倫比的優(yōu)點(diǎn)。但是，現(xiàn)有恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)所用原料量大、成本昂貴，極大地限制了恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)在基礎(chǔ)理論研宄領(lǐng)域的推廣和商業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種原料用量少、成本低的微小反應(yīng)體系水平上的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法，具體步驟如下:以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
一種微小反應(yīng)體系水平上的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法，具體步驟如下:
1)在200μ I的PCR管中配制微小反應(yīng)體系:
引物液:0.36-1.44 μ 1，反應(yīng)液:3.04-12.16 μ 1，DNA 聚合酶:0.2-0.8 μ 1，SYTO-9:
0.2-0.8 μ 1，待檢 DNA:0.2-4.8 μ 1，用 DNase/RNase-Free 蒸餾水補(bǔ)齊到 5-20 μ I ；
2)恒溫檢測反應(yīng):設(shè)置陽性對照反應(yīng)時(shí)，用含有目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于溫度設(shè)置為60-65°C的PCR儀上反應(yīng)45-90min，并在80°C下持續(xù)反應(yīng)2min ；
3)結(jié)果判斷:在上述PCR管中加入2μI熒光顯色劑，混勻，陽性質(zhì)粒顯現(xiàn)為綠色，陰性質(zhì)粒顯現(xiàn)為橙色，且陽性質(zhì)粒顯現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性質(zhì)粒顯現(xiàn)直線擴(kuò)增曲線，陽性質(zhì)粒、陰性質(zhì)粒在該微小反應(yīng)體系水平上均實(shí)現(xiàn)正常擴(kuò)增。
[0005]作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述引物液包含50 μ M第一外引物、50 μ M第二外引物，50 μ M第一內(nèi)引物、50 μ M第二內(nèi)引物;
所述第一外引物為 TAAGTAITTGGGAGAAGGGA ；
第二外引物為 AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA ；
第一內(nèi)引物為
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA ；
第二內(nèi)引物為 GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG ；
所述反應(yīng)液包含12mM的dNTP、等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液、150mM的硫酸鎂水溶液，dNTP、反應(yīng)緩沖液體積比是8:5:2 ;
所述DNA聚合酶為fciDNA聚合酶，濃度為8U/ μ I ;
所述核酸中陽性質(zhì)粒為含有目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性質(zhì)粒為不含目的基因的反應(yīng)混合液；
所述熒光顯色劑為SYT0-9。
[0006]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明利用微小反應(yīng)體系為恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)提供一種降低原料用量和成本的新途徑，能極大地節(jié)省恒溫核酸擴(kuò)增所用原料，降低所需成本，從而極大地推動(dòng)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)在基礎(chǔ)理論研宄領(lǐng)域的推廣和商業(yè)化應(yīng)用。
【附圖說明】
[0007]圖1為本發(fā)明中實(shí)施例1的恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測結(jié)果圖。
[0008]圖2為本發(fā)明中實(shí)施例2的恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測結(jié)果圖。
[0009]圖3為本發(fā)明中實(shí)施例3的恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測結(jié)果圖。
[0010]圖4為本發(fā)明中實(shí)施例4的恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0012]實(shí)施例1
請參閱圖1，本發(fā)明實(shí)施例中，一種20 μ I反應(yīng)體系水平上的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法，具體步驟如下:
1)在200μ I的PCR管中配制微小反應(yīng)體系:
引物液:1.44μ1，反應(yīng)液:12.16μ1，DNA 聚合酶:0.8μ1，SYTO-9:0.8 μ 1，待檢 DNA:3.2 μ 1，用 DNase/RNase-Free 蒸餾水補(bǔ)齊到 20 μ I ；
2)恒溫檢測反應(yīng):設(shè)置陽性對照反應(yīng)時(shí)，用含有目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于溫度設(shè)置為65°C的PCR儀上反應(yīng)90min，并在80°C下持續(xù)反應(yīng)2min ;
3)結(jié)果判斷:在上述PCR管中加入2μI熒光顯色劑，混勻，陽性質(zhì)粒顯現(xiàn)為綠色，陰性質(zhì)粒顯現(xiàn)為橙色，且陽性質(zhì)粒顯現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性質(zhì)粒顯現(xiàn)直線擴(kuò)增曲線，陽性質(zhì)粒、陰性質(zhì)粒在該微小反應(yīng)體系水平上均實(shí)現(xiàn)正常擴(kuò)增。
[0013]所述引物液包含50 μ M第一外引物、50 μ M第二外引物，50 μ M第一內(nèi)引物、50 μ M第二內(nèi)引物；
所述第一外引物為 TAAGTAITTGGGAGAAGGGA ；
第二外引物為 AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA ；
第一內(nèi)引物為
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA ；
第二內(nèi)引物為 GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG ；
所述反應(yīng)液包含12mM的dNTP、等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液、150mM的硫酸鎂水溶液，dNTP、反應(yīng)緩沖液體積比是8:5:2 ;
所述DNA聚合酶為fciDNA聚合酶，濃度為8U/ μ I ;
所述核酸中陽性質(zhì)粒為含有目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性質(zhì)粒為不含目的基因的反應(yīng)混合液； 所述熒光顯色劑為SYT0-9。
[0014]實(shí)施例2
請參閱圖2，本發(fā)明實(shí)施例中，一種15 μ I反應(yīng)體系水平上的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法，具體步驟如下:
1)在200μ I的PCR管中配制微小反應(yīng)體系:
引物液:1.08 μ 1，反應(yīng)液:9.12 μ 1，DNA 聚合酶:0.6μ 1，SYTO-9:0.6 μ 1，待檢 DNA:2.4 μ 1，用 DNase/RNase-Free 蒸飽水補(bǔ)齊到 15 μ I ;
2)恒溫檢測反應(yīng):設(shè)置陽性對照反應(yīng)時(shí)，用含有目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于溫度設(shè)置為64°C的PCR儀上反應(yīng)70min，并在80°C下持續(xù)反應(yīng)2min ;
3)結(jié)果判斷:在上述PCR管中加入2μI熒光顯色劑，混勻，陽性質(zhì)粒顯現(xiàn)為綠色，陰性質(zhì)粒顯現(xiàn)為橙色，且陽性質(zhì)粒顯現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性質(zhì)粒顯現(xiàn)直線擴(kuò)增曲線，陽性質(zhì)粒、陰性質(zhì)粒在該微小反應(yīng)體系水平上均實(shí)現(xiàn)正常擴(kuò)增。
[0015]所述引物液包含50 μ M第一外引物、50 μ M第二外引物，50 μ M第一內(nèi)引物、50 μ M第二內(nèi)引物；
所述第一外引物為 TAAGTAITTGGGAGAAGGGA ；
第二外引物為 AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA ；
第一內(nèi)引物為
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA ；
第二內(nèi)引物為 GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG ；
所述反應(yīng)液包含12mM的dNTP、等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液、150mM的硫酸鎂水溶液，dNTP、反應(yīng)緩沖液體積比是8:5:2 ;
所述DNA聚合酶為fciDNA聚合酶，濃度為8U/ μ I ;
所述核酸中陽性質(zhì)粒為含有目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒