優(yōu)化的Fc變體及其產(chǎn)生方法
【專利說明】優(yōu)化的Fe變體及其產(chǎn)生方法 本申請是申請日為2004年3月26日、中國申請?zhí)枮?01210057793. 1、發(fā)明名稱為"優(yōu) 化的Fe變體及其產(chǎn)生方法"的發(fā)明申請的分案申請。 本申請是2003年9月26日提交的USSN10/672,280的繼續(xù)申請，根據(jù)35U.S.C. § 199 (e)，要求于2003年9月26日提交的USSN10/672280 ;2003年3月3日提交的USSN 10/379392 ;2003 年 6 月 12 日提交的USSN60/477, 839 ;2003 年 5 月 2 日提交的USSN 60/467, 606 ;2002 年 9 月 27 日提交的USSN60/414, 433 ;和 2003 年 1 月 23 日提交的USSN 60/442, 301的權(quán)益，所有它們?nèi)膬?nèi)容在此明確引用作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及新的優(yōu)化的Fe變體，產(chǎn)生它們的改造（engineering)方法，以及它們的應(yīng) 用，具體而言用于治療目的。 發(fā)明背景 抗體是結(jié)合特異性抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠的大多數(shù)哺乳動物中，抗體由配 對的多肽重鏈和多肽輕鏈構(gòu)成。每條鏈由分離的免疫球蛋白（Ig)結(jié)構(gòu)域組成，因此上述蛋 白通稱免疫球蛋白。每條鏈由兩個不同的區(qū)組成，稱為可變區(qū)及恒定區(qū)。在抗體間輕鏈和 重鏈可變區(qū)顯示了明顯的序列多樣性，并負責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示了較少的序列多樣 性，并負責(zé)結(jié)合許多天然蛋白以引發(fā)重要的生化反應(yīng)。在人類中有五種不同類型的抗體，包 括IgA(其包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亞類IgGl、IgG2、IgG3 和IgG4) 以及IgM。盡管在V區(qū)可能存在微小的差異，但是在這些類型的抗體間區(qū)別特征是它們的恒 定區(qū)。圖1顯示了IgGl抗體，在此用于舉例說明免疫球蛋白的大致結(jié)構(gòu)特征，IgG抗體是 由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體蛋白。IgG重鏈由四個相連的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成， 從N-末端到C-末端依次為VH-CyI-Cy2-Cy3,分別稱為重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)y1 結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)y2結(jié)構(gòu)域和恒定區(qū)y3結(jié)構(gòu)域。IgG輕鏈由兩個相連的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 組成，從N-末端到C-末端依次為Q，分別稱為輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。 抗體的可變區(qū)含有該分子的抗原結(jié)合決定基，并因此決定了抗體對其靶抗原的特異 性。因為其與同一類型中其它抗體序列差別最明顯，所以命名為可變區(qū)。大多數(shù)序列可變 性存在于互補決定區(qū)（⑶Rs)。總共有6個⑶Rs，每條重鏈和輕鏈各有3個，命名SVhCDRU VhCDR2、VhCDR3、'CDR1、'CDR2及'CDR3。在CDRs外的可變區(qū)稱為骨架（FR)區(qū)。盡管 不像CDRs-樣變化眾多，但是在不同抗體間FR區(qū)存在序列可變性?？偟膩碚f，抗體的結(jié)構(gòu) 特征提供了穩(wěn)定的支架（FR區(qū)），在其上真正的抗原結(jié)合多樣性（CDR)能得到研宄，通過免 疫系統(tǒng)以獲得對廣泛抗原的特異性。可獲得多種來自不同生物體可變區(qū)片段的許多高分辨 率結(jié)構(gòu)，一些可變區(qū)是非結(jié)合狀態(tài)的，一些與抗原形成復(fù)合物?？贵w可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)特 征得到充分鑒定（Morea等?，1997,BiophysChem68 :9-16 ;Morea等?，2000,Methods20 : 267-279)，抗體的保守特征已用于發(fā)展許多抗體改造技術(shù)（Maynard等.，2000,AnnuRev BiomedEng2 :339-376)。例如，可將來自一種抗體，如鼠抗體的⑶Rs移植入另一種抗體的 骨架區(qū)，如人抗體。在本領(lǐng)域稱為"人源化"的該過程能從非人抗體中能產(chǎn)生具更低免疫原 性的抗體治療劑。存在著包含可變區(qū)的片段，其缺少抗體其它區(qū)域，包括諸如包含vh-cyI和Vh-Q的抗原結(jié)合片段（Fab)、包含的可變區(qū)片段（Fv)、包含在同一鏈中連接在 一起的％和八的單鏈可變區(qū)片段（scFv)以及多種其它可變區(qū)片段（Little等.，2000， Tmmun〇IToday21:364-370)。 抗體的Fc區(qū)與許多Fc受體及配體相互作用，行使一系列重要的功能，稱為效應(yīng)器功能(effectorfunction)。如圖1所示，IgGFc區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域Cy2、Cy3和進入Cy2的 N-末端鉸鏈。對于IgG類而言，一類重要的Fc受體家族是FeY受體（FcyR)。這些受體介 導(dǎo)抗體與免疫系統(tǒng)的細胞臂之間的信息傳遞（communication) (Raghavan等?，1996,Annu RevCellDevBiol12 :181-220;Ravetch等?，2001，AnnuRevImmunol19 :275-290) 〇 在人類中，該蛋白質(zhì)家族包含F(xiàn)eYRI(CD64)，包括同種型（isoform)FeYRIa、FeYRIb和 FeyRIc;FcyRII(CD32)，包括同種型FeyRIIa(包含同種異型（allotype)H131 和R131)、 FeyRIIb(包含F(xiàn)eyRIIb-I和FeyRIIb-2)以及FeyRIIc;和FeyRIII(CD16)，包括同種 型FcyRIIIa(包含同種異型V158和F158)和FcyRIIIb(包括同種異型FcyRIIIb-NAl 和FcyRIIIb-NA2)(Jefferis等，2002,ImmunolLett82:57-65)。這些受體通常具有介 導(dǎo)與Fe結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和可介導(dǎo)某些細胞內(nèi)信號事件的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些受 體在不同的免疫細胞中表達，包括單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性細 胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、朗罕氏細胞，自然殺傷（NK)細胞以及YYT 細胞。Fc/FcYR復(fù)合物的形成招募這些效應(yīng)細胞至結(jié)合抗原的位點，通常導(dǎo)致細胞內(nèi)信號 事件以及隨后重要的免疫應(yīng)答發(fā)生，諸如釋放炎癥介質(zhì)、B細胞活化、細胞內(nèi)吞作用、吞噬 作用及細胞毒性攻擊。介導(dǎo)細胞毒性和吞噬細胞效應(yīng)器功能的能力是抗體破壞靶細胞的 一種可能機制。在細胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達FeYR的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的 結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致靶細胞溶胞作用，稱為抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（ADCC) (antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity)(Raghavan等?，1996，AnnuRevCell DevBiol12 :181-220;Ghetie等?，2000，AnnuRevImmunol18 :739-766;Ravetch等?， 2001，AnnuRevImmunol19:275-290)。在細胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達FcyR的非特異性細胞毒 性細胞識別靶細胞上的結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致對靶細胞的吞噬作用，稱為抗體依賴性細胞 介導(dǎo)的細胞吞作用（ADCP)(antibodydependentcell-mediatedphagocytosis)。已解 出人FeyR的胞外結(jié)構(gòu)域的許多結(jié)構(gòu)，包括FeyRIIa(pdb登記號1H9V) (Sondermann等.， 2001，JMolBiol309 :737-749)(pdb登記號 1FCG)(Maxwell等?，1999,NatStructBiol 6 :437-442)，F(xiàn)cyRIIb(pdb登記號 2FCB)(Sondermann等.，1999,EmboJ18:1095-1103); 以及FeyRIIIb(pdb登記號 1E4J)(Sondermann等?，2000,Nature406 :267-273.)。所有 FeyR結(jié)合Fc上相同區(qū)域，位于Cy2結(jié)構(gòu)域的N-末端和前述鉸鏈區(qū)，如圖2所示。該相互 作用可很容易地通過結(jié)構(gòu)來鑒定（Sondermann等.，2001，JMolBiol309 :737-749)，并已 解出與人FeyRIIIb胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人Fc的數(shù)種結(jié)構(gòu)（pdb登記號1E4K)(Sondermann 等.，2000,Nature406 :267-273.)(pdb登記號IIIS和 1IIX)(Radaev等.，2001，JBiol Chem276 :16469-16477)，也解出人IgEFc/FcgRIa復(fù)合物結(jié)構(gòu)（pdb登記號 1F6A)(Garman 等?，2000,Nature406 :259-266) 〇 不同IgG亞類對FeYR具有不同親和力，IgGl和IgG3 -般較IgG2和IgG4能更充