專利名稱：優(yōu)化的Fc變體及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的優(yōu)化的Fe變體,產(chǎn)生它們的改造(engineering)方法，以及它們的應(yīng)用，具體而言用于治療目的。
背景技術(shù)：
抗體是結(jié)合特異性抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠的大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，抗體由配對(duì)的多肽重鏈和多肽輕鏈構(gòu)成。每條鏈由分離的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域組成，因此上述蛋白通稱免疫球蛋白。每條鏈由兩個(gè)不同的區(qū)組成，稱為可變區(qū)及恒定區(qū)。在抗體間輕鏈和重鏈可變區(qū)顯示了明顯的序列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示了較少的序列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白以引發(fā)重要的生化反應(yīng)。在人類中有五種不同類型的抗體，包括IgA (其包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG (其包括亞類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。盡管在V區(qū)可能存在微小的差異，但是在這些類型的抗體間區(qū)別特征是它們的恒定區(qū)。圖I顯示了 IgGl抗體，在此用于舉例說(shuō)明免疫球蛋白的大致結(jié)構(gòu)特征，IgG抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體蛋白。IgG重鏈由四個(gè)相連的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，從N-末端到C-末端依次為Vh-C Y I-C Y2-CY3,分別稱為重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)Y I結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)Y2結(jié)構(gòu)域和恒定區(qū)Υ3結(jié)構(gòu)域。IgG輕鏈由兩個(gè)相連的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，從N-末端到C-末端依次為'-Cy分別稱為輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。抗體的可變區(qū)含有該分子的抗原結(jié)合決定基，并因此決定了抗體對(duì)其靶抗原的特異性。因?yàn)槠渑c同一類型中其它抗體序列差別最明顯，所以命名為可變區(qū)。大多數(shù)序列可變性存在于互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)?？偣灿?個(gè)⑶Rs，每條重鏈和輕鏈各有3個(gè)，命名SVhCDRUVhCDR2、VhCDR3、Vl⑶Rl、Vl⑶R2及VlCDR3。在⑶Rs外的可變區(qū)稱為骨架(FR)區(qū)。盡管不像CDRs —樣變化眾多，但是在不同抗體間FR區(qū)存在序列可變性。總的來(lái)說(shuō)，抗體的結(jié)構(gòu)特征提供了穩(wěn)定的支架(FR區(qū))，在其上真正的抗原結(jié)合多樣性(CDR)能得到研究，通過(guò)免疫系統(tǒng)以獲得對(duì)廣泛抗原的特異性?？色@得多種來(lái)自不同生物體可變區(qū)片段的許多高分辨率結(jié)構(gòu)，一些可變區(qū)是非結(jié)合狀態(tài)的，一些與抗原形成復(fù)合物?？贵w可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)特征得到充分鑒定(Morea 等.，1997, Biophys Chem 68 :9_16 ；Morea 等.,2000, Methods 20 267-279),抗體的保守特征已用于發(fā)展許多抗體改造技術(shù)(Maynard等.，2000, Annu RevBiomed Eng 2 :339-376)。例如，可將來(lái)自一種抗體，如鼠抗體的⑶Rs移植入另一種抗體的骨架區(qū)，如人抗體。在本領(lǐng)域稱為“人源化”的該過(guò)程能從非人抗體中能產(chǎn)生具更低免疫原性的抗體治療劑。存在著包含可變區(qū)的片段，其缺少抗體其它區(qū)域，包括諸如包含Vh-Cy I和Vh-Q的抗原結(jié)合片段(Fab)、包含Vh和\的可變區(qū)片段(Fv)、包含在同一鏈中連接在一起的Vh和Vl的單鏈可變區(qū)片段(scFv)以及多種其它可變區(qū)片段(Little等.，2000，Tmmunol Today 21 :364-370)?？贵w的Fe區(qū)與許多Fe受體及配體相互作用，行使一系列重要的功能，稱為
效應(yīng)器功能(effector function)。如圖I所示，IgG Fe區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域C Y 2、C Y 3和進(jìn)入C Y 2的N-末端鉸鏈。對(duì)于IgG類而言，一類重要的Fe受體家族是Fe Y受體(Fe y R)。這些受體介導(dǎo)抗體與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞臂之間的信息傳遞(communication) (Raghavan等.，1996, AnnuRev Cell Dev Biol 12 :181-220;Ravetch 等·，2001, Annu Rev Tmmunol 19:275-290)。在人類中，該蛋白質(zhì)家族包含F(xiàn)e Y RI (CD64)，包括同種型(isoform) Fe y RIa、Fe y RIb和Fe Y RIc ;Fc yRII(CD32)，包括同種型 Fe YRIIa(包含同種異型(allotype)H131 和 R131)、Fe Y RIIb (包含 Fe Y RIIb-I 和 Fe y RIIb-2)以及 Fe y RIIc ;和 Fe y RIII (CD16)，包括同種型Fe YRIIIa(包含同種異型V158和F158)和Fe Y RIIIb (包括同種異型Fe y RIIIb-NAl和 Fe YRIIIb-NA2) (Jefferis 等，2002，Immunol Lett 82:57-65)。這些受體通常具有介導(dǎo)與Fe結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和可介導(dǎo)某些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些受體在不同的免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗罕氏細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞以及YYT細(xì)胞。Fc/Fc Y R復(fù)合物的形成招募這些效應(yīng)細(xì)胞至結(jié)合抗原的位點(diǎn)，通常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件以及隨后重要的免疫應(yīng)答發(fā)生，諸如釋放炎癥介質(zhì)、B細(xì)胞活化、細(xì)胞內(nèi)吞作用、吞噬作用及細(xì)胞毒性攻擊。介導(dǎo)細(xì)胞毒性和吞噬細(xì)胞效應(yīng)器功能的能力是抗體破壞靶細(xì)胞的一種可能機(jī)制。在細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達(dá)Fe Y R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞溶胞作用，稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)(Raghavan等·，1996,Annu Rev CellDev Biol 12 :181-220 ；Ghetie 等·，2000, Annu Rev Tmmunol 18 :739-766 ；Ravetch 等·，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。在細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達(dá)Fe γ R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致對(duì)靶細(xì)胞的吞噬作用，稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞卩遼作用(ADCP) (antibody dependent cell-mediated phagocytosis)。已解出人Fe Y R的胞外結(jié)構(gòu)域的許多結(jié)構(gòu),包括Fe Y RIIa(pdb登記號(hào)1H9V) (Sondermann等.，2001，JMol Biol 309 :737-749) (pdb 登記號(hào) 1FCG) (Maxwell 等·，1999，Nat Struct Biol6 :437-442)，F(xiàn)e y RIIb (pdb 登記號(hào) 2FCB) (Sondermann 等·，1999，Embo J18 :1095-1103)；以及 Fe YRIIIb (pdb 登記號(hào) 1E4J) (Sondermann 等·，2000，Nature 406 :267-273.)。所有Fe Y R結(jié)合Fe上相同區(qū)域，位于C Y 2結(jié)構(gòu)域的N-末端和前述鉸鏈區(qū)，如圖2所示。該相互作用可很容易地通過(guò)結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定(Sondermann等·，2001，J Mol Biol 309 :737-749)，并已解出與人Fe Y RIIIb胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人Fe的數(shù)種結(jié)構(gòu)(pdb登記號(hào)1E4K) (Sondermann等.,2000，Nature 406 :267-273.) (pdb 登記號(hào) IIIS 和 11IX) (Radaev 等· ,2001, JBiol Chem276 :16469-16477),也解出人 IgE Fc/Fc ε RI α 復(fù)合物結(jié)構(gòu)(pdb 登記號(hào) 1F6A) (Garman等· ,2000, Nature406 :259-266)。不同IgG亞類對(duì)Fe Y R具有不同親和力，IgGl和IgG3 —般較IgG2和IgG4能更充分地與受體結(jié)合(Jefferis 等·，2002，Immunol Lett 82 :57-65)。所有 Fe y R 結(jié)合 IgGFe上相同的區(qū)域，亦具有不同的親和力高親和力受體Fe Y RI對(duì)IgG具有10ΛΓ1的Kd，反之低親和力受體Fe YRII和Fe Y RIII通常分別以10_6和lO—^T1的Kd結(jié)合。FcyRIIIa與Fe Y RIIIb胞外結(jié)構(gòu)域具有96%同一性，但是Fe Y RIIIb沒(méi)有胞內(nèi)信號(hào)域。此外，盡管FcyRI, Fcy RIIa/c和Fe Y RIIIa是免疫復(fù)合物觸發(fā)激活作用的正調(diào)節(jié)物，通過(guò)具有含有基于免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域而得到鑒定，但是FcYRIIb含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)并因此而具有抑制性。因此，前者稱為激活性受體而Fe Y RIIb稱為抑制性受體。在不同的免疫細(xì)胞中受體也具有不同的表達(dá)譜和表達(dá)水平。然而，在人蛋白質(zhì)組中另一種復(fù)雜性水平是存在著許多Fe YR多態(tài)性。與臨床意義特別相關(guān)的多態(tài)性是V158/F158Fc y RIIIa0人IgGl與V158同種異型的結(jié)合較與F158同種異型的結(jié)合具更高親和力。不同親和力以及其對(duì)ADCC和 /或ADCP的可能影響已顯示了是抗-CD20抗體利妥昔單抗(rituximab) ( Rituxan , IDEC Pharmaceuticals Corporation 的注冊(cè)商標(biāo))功效的重要決定因素。具有V158同種異型的患者對(duì)利妥昔單抗治療響應(yīng)良好；然而，具有低親和力F158同種異型的患者響應(yīng)不良(Cartron等，2002，Blood 99 =754-758)。大約10-20 %的人是V158/V158純合子，45 %是V158/F158雜合子，以及35-45 %的人是F158/F158 純合子(Lehmbecher 等·，1999，Blood 94 :4220-4232 ；Cartron 等· ,2002, Blood 99 754-758)。因此80-90%的人是不良應(yīng)答者，它們具有至少一個(gè)F158Fc y RIIIa的等位基因。圖I顯示了 Fe上重疊但分離的位點(diǎn)，其作為與補(bǔ)體蛋白Clq作用的界面。同樣地， (3作(3￥1 結(jié)合介導(dǎo)了40(1，？(3/(4結(jié)合介導(dǎo)了補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(⑶C)。Clq與絲氨酸蛋白酶Clr形成復(fù)合物，再與Cls形成Cl復(fù)合物。雖然Clq與兩種IgGs的結(jié)合就足以激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，但是其能結(jié)合6種抗體。類似于Fe與Fe Y R的相互作用，不同IgG亞類對(duì)Clq具有不同親和力，IgGl和IgG3 一般較IgG2和IgG4能更充分地與Fe Y R結(jié)合(Jefferis等.，2002，Immunol Lett 82:57-65)。當(dāng)前沒(méi)有獲得Fc/Clq復(fù)合物結(jié)構(gòu)；但是，誘變研究已將人IgG上與Clq的結(jié)合位點(diǎn)定位于包含殘基D270、K322、K326、P329和P331，以及E333的區(qū)域(Idusogie 等·，2000, J Tmmunol 164 :4178-4184 ；Idusogie 等，2001, J Tmmunol166 :2571-2575)。圖I顯示了 Fe上Cy2和Cy3結(jié)構(gòu)域之間的位點(diǎn)，其介導(dǎo)與新生受體FcRn的相互作用，它們的結(jié)合使胞吞的抗體從內(nèi)涵體再循環(huán)回血液中(Raghavan等.，1996, AnnuRev Cell Dev Biol 12 :181-220 ;Ghetie 等·，2000，Annu Rev Immunol 18:739-766)。該過(guò)程結(jié)合由于較大尺寸的全長(zhǎng)分子不被腎濾過(guò)，產(chǎn)生了有利的抗體血清半衰期，該半衰期變化范圍從一周到三周。在抗體轉(zhuǎn)運(yùn)中Fe與FcRn的結(jié)合也扮演著關(guān)鍵角色。Fe上結(jié)合FcRn的結(jié)合位點(diǎn)也是細(xì)菌蛋白A和G的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)在蛋白純化過(guò)程中使用蛋白A或蛋白G親和層析，這些蛋白質(zhì)的牢固結(jié)合通常用作為純化抗體的手段。因此，對(duì)于抗體的臨床性能及其純化而言，F(xiàn)e上該區(qū)域的可信度具有重要作用。已獲得的大鼠Fc/FcRn復(fù)合物結(jié)構(gòu)(Martin等· ,2001, Mol Cell 7 :867-877)，以及Fe與蛋白A和G的復(fù)合物結(jié)構(gòu)(Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20 :2361-2370 ;Sauer-Eriksson 等·，1995, Structure3 :265-278 ；Tashiro 等·，1995，Curr Opin Struct Biol 5 :471-481)提供了對(duì) Fe 與這些蛋白相互作用的了解。
在Fe區(qū)起關(guān)鍵作用的是存在于N297的保守的N-連接的糖基化，如圖I所示。對(duì)于抗體而言，該糖，或有時(shí)稱為寡糖的，扮演著關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能角色，并且是使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的主要原因之一。雖然不應(yīng)限制于一種理論，但據(jù)信該糖結(jié)構(gòu)上的用途可穩(wěn)定或增溶Fe，決定C Y 3與C Y 2結(jié)構(gòu)域間特定角度或柔性程度，阻止兩個(gè)CY2結(jié)構(gòu)域橫越中心軸的相互聚集，或這些的組合。Fe與FcyR以及Clq的有效結(jié)合需要這種修飾，N297糖組成的改變或消除影響這些蛋白的結(jié)合(Umana等.，1999，NatBiotechnoll7 :176-180 ;Davies 等·，2001, Biotechnol Bioeng 74 :288-294 ;Mimura 等，2001,J Biol Chem 276 :45539-45547. ;Radaev等·,2001,J Biol Chem 276 :16478-16483 ；Shields 等·，2001，J Biol Chem 276 :6591-6604 ；Shields 等·，2002，J Biol Chem 277 26733-26740 ;Simmons 等·，2002，J Immunol Methods 263:133-147)。然而，即使與 Fe Y R有任何特異性接觸，該糖的參與也少(Radaev等.，2001，J Biol Chem 276 :16469-16477)，表明在介導(dǎo)Fc/Fc YR結(jié)合中N297糖的功能角色可能是通過(guò)在決定Fe構(gòu)象中其所扮演的結(jié)構(gòu)角色來(lái)實(shí)現(xiàn)的。該結(jié)論通過(guò)所收集到的四個(gè)不同F(xiàn)e糖型(glycoform)的晶體結(jié)構(gòu)而得到支持，這些結(jié)構(gòu)顯示了寡糖影響了 C Y 2構(gòu)象并因此影響Fc/Fc Y R界面(Krapp等.，2003，J Mol Biol 325 :979-989)。
上述所討論的抗體特征-特異于靶，能介導(dǎo)免疫效應(yīng)機(jī)制及在血清中的長(zhǎng)半衰期-使得抗體可有效地用于治療。單克隆抗體可用于治療多種疾病，包括癌癥、炎癥和心血管病。目前已有超過(guò)10種抗體產(chǎn)品上市，并有數(shù)百種產(chǎn)品正在開(kāi)發(fā)中。除抗體外，在研究和治療中發(fā)現(xiàn)Fe融合體這類抗體樣蛋白用途廣泛(Chamow等·，1996, Trends Biotechnol14 :52-60 ;Ashkenazi 等，1997, Curr Opin Tmmunol 9 :195-200)。Fe 融合體是一種蛋白質(zhì)，其中一個(gè)或多個(gè)多肽可操作地連接Fe。Fe融合體使抗體的Fe區(qū)與受體的靶結(jié)合區(qū)、配體或一些其它蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并因此有利于其效應(yīng)器功能和藥物代謝動(dòng)力學(xué)。后者的角色是用于介導(dǎo)靶識(shí)別，并因而在功能上與抗體可變區(qū)相似。因?yàn)镕e融合體與抗體在結(jié)構(gòu)和功能上重疊，所以在本發(fā)明中對(duì)于抗體的討論可直接擴(kuò)展至Fe融合體。盡管具有這樣廣泛的用途，對(duì)于臨床使用而言，抗體并不是優(yōu)化的?？贵w的兩個(gè)主要缺點(diǎn)是它們并不理想的抗癌效力和它們過(guò)分苛求的生產(chǎn)必備條件。本發(fā)明解決了這些缺陷。存在許多可能的抗體破壞腫瘤細(xì)胞機(jī)制，包括通過(guò)阻斷必需的生長(zhǎng)途徑以抗增殖、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)信號(hào)、增強(qiáng)的下調(diào)作用和/或受體的轉(zhuǎn)換(turnover)、CDC、ADCC,ADCP 以及啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答(adaptive immune response) (Cragg 等· , 1999, Curr OpinTmmunol 11 :541-547 ;Glennie 等·，2000, Tmmunol Today 21:403-410)?？鼓[瘤效力可基于這些機(jī)制的組合，而且在臨床治療中它們各自的重要性依腫瘤的不同而不同。盡管是抗腫瘤武器的兵工廠，但是抗體作為抗癌劑的效果卻并不令人滿意，具體而言是它們的高成本?；颊吣[瘤響應(yīng)數(shù)據(jù)顯示了相對(duì)于常規(guī)的單一試劑細(xì)胞毒素化學(xué)療法而言，在治療成功率上單克隆抗體僅提供了很少的改善。舉例來(lái)說(shuō)，在全部復(fù)發(fā)的低度非霍奇金淋巴瘤患者中只有一半對(duì)抗-CD20抗體利妥昔單抗響應(yīng)(McLaughlin等·，1998，J Clin Oncol 16 2825-2833)。在166個(gè)臨床患者中，6%顯示了完全響應(yīng)，42%顯示了部分響應(yīng)，中值響應(yīng)持續(xù)時(shí)間大約為12個(gè)月。曲妥單抗(Herceptin , Genentech的注冊(cè)商標(biāo))，一種用于治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的抗-HER2/neu抗體，具有較低的療效。對(duì)222個(gè)受試患者使用曲妥單抗的總響應(yīng)率僅有15%，其中8個(gè)完全響應(yīng)，26個(gè)部分響應(yīng)，中值響應(yīng)持續(xù)時(shí)間和存活時(shí)間為9-13個(gè)月(Cobleigh等.，1999，J Clin Oncol 17:2639-2648)。目前對(duì)于抗癌治療而言，在死亡率上任何小的改善都意味著成功。因此，特別需要增強(qiáng)抗體破壞靶癌細(xì)胞的能力。一種用于增強(qiáng)抗體抗腫瘤效力的有希望的方法是通過(guò)增加它們介導(dǎo)諸如ADCC、ADCP和CDC的細(xì)胞毒性效應(yīng)器功能的能力。對(duì)于抗體抗癌活性而言，F(xiàn)e Y R-介導(dǎo)的效應(yīng)器功能的重要性已在小鼠中得到證實(shí)(Clynes等·，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656 ;Clynes等.，2000，Nat Med6 :443-446)，并在基于細(xì)胞的測(cè)定中證實(shí)了與靶細(xì)胞毒性相關(guān)的Fe與特定FcyR之間相互作用的親和力(Shields等·，2001，J Biol Chem276 :6591-6604 ;Presta 等· , 2002, Biochem Soc Trans 30 :487-490 ;Shields 等·，2002，JBiol Chem 277:26733-26740)。此外，已觀察到人臨床療效與它們的同種異型-Fe Y RIIIa的高親和力多態(tài)型(V158)或低親和力多態(tài)型(F158)之間的相互關(guān)系(Cartron等·，2002，Blood 99:754-758)。綜合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)提示了對(duì)于與特定Fe Y R結(jié)合而言，在患者體內(nèi) 具有Fe區(qū)優(yōu)化的抗體能更好地介導(dǎo)效應(yīng)器功能并因此能更有效地破壞癌細(xì)胞。在激活與抑制受體之間的平衡要得到重點(diǎn)考慮，并應(yīng)由Fe產(chǎn)生最佳的效應(yīng)器功能，對(duì)諸如Fe Y RI、Fe Y RIIa/c以及Fe Y RIIIa的激活受體而言應(yīng)具有增強(qiáng)的親和力，還應(yīng)減少對(duì)抑制性受體Fe Y RIIb的親和力。此外，因?yàn)镕e Y R能介導(dǎo)通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞的抗原攝入和加工過(guò)程，所以增強(qiáng)Fc/Fc Y R親和力也能改善抗體治療能力以引發(fā)獲得性免疫應(yīng)答。為不同目的對(duì)Fe進(jìn)行誘變研究，通常對(duì)丙氨酸進(jìn)行取代(稱為丙氨酸掃描)或通過(guò)序列同源性取代指導(dǎo)進(jìn)行取代(Duncan等.，1988, Nature 332 :563-564 ；Lund等.，1991，JImmunol 147 :2657-2662 ；Lund 等·，1992，Mol Immunol 29 :53-59 Jefferis 等，
1995,Tmmunol Lett 44 :111-117 ；Lund 等·，1995, Faseb J9 :115-119 ；Jefferis 等·，
1996,Tmmunol Lett 54 :101-104 ;Lund 等，1996, J Tmmunol 157 :4963-4969 ;Armour 等，1999，Eur J Immunol 29 :2613-2624 ；Shields 等·，2001，J Biol Chem 276 :6591-6604 ；Jefferis 等·，2002，Immunol Lett 82 :57-65)(US 5, 624, 821 ；US 5, 885, 573 ；PCT WO00/42072 ；PCTW0 99/58572)。大多數(shù)取代減少或消除了與Fe γ R的結(jié)合。另一方面，在獲得具有更高Fe Y R親和力的Fe變體方面已取得了一些成功(參見(jiàn)例如US5，624，821和PCT WO 00/42072)。例如，Winter及其同事在小鼠IgG2b抗體的235位上用人氨基酸進(jìn)行取代(谷氨酸到亮氨酸突變)，該小鼠抗體與人Fe Y RI的結(jié)合增加了 100倍(Duncan等·，1988，Nature 332 :563-564) (US5, 624，821)。Shields 等使用丙氨酸掃描誘變來(lái)定位對(duì)Fe Y R結(jié)合起重要作用的Fe殘基，然后通過(guò)用非丙氨酸突變對(duì)所選定的殘基進(jìn)行取代(Shields 等·，2001，J Biol Chem 276 :6591-6604 ;Presta 等·，2002，Biochem Soc Trans30 :487-490) (PCT WO 00/42072)。該研究公開(kāi)了一些突變，包括 S298A、E333A 和 K334A，顯示了與激活受體Fe YRIIIa增強(qiáng)的結(jié)合以及減少了與抑制性受體Fe y RIIb的結(jié)合。組合這些突變以獲得雙重和三重突變的變體，在結(jié)合方面其顯示了累加的改善。在該研究中所公開(kāi)的最好的變體是S298A/E333A/K334A三重突變體，其與F158Fc Y RIIIa的結(jié)合大約增加了 I. 7倍，與Fe Y RIIb的結(jié)合減少了 5倍，且ADCC增加了 2. I倍。使用改造后的糖型(engineered glycoform)也已實(shí)現(xiàn)了 Fe對(duì)Fe Y R增強(qiáng)的親和力，該糖型產(chǎn)生自工程改造的或變異的細(xì)胞系中抗體的表達(dá)(Umana等.，1999，NatBiotechnol 17 :176-180 ;Davies 等，2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294 ;Shields等·，2002，J Biol Chem277 :26733-26740 ；Shinkawa 等·，2003，J Biol Chem278 3466-3473)。該方法產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)上增加的抗體與Fe γ RIIIa結(jié)合并介導(dǎo)ADCC的能力。盡管在實(shí)踐中存在諸如在大規(guī)模生產(chǎn)條件下表達(dá)菌株生長(zhǎng)效率的局限性，用于增強(qiáng)Fc/Fc Y R親和力以及效應(yīng)器功能的該方法仍然是有前途的。實(shí)際上，對(duì)于優(yōu)化效應(yīng)器功能來(lái)說(shuō)，將這些可選的糖型技術(shù)與本發(fā)明的Fe變體結(jié)合可提供累加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。盡管需要更強(qiáng)的效應(yīng)器功能，對(duì)于某些抗體治療劑而言，減少或消除效應(yīng)器功能也許是其所需的。通常認(rèn)為治療性抗體其作用機(jī)理包括阻斷或拮抗但不殺死具有靶抗原的細(xì)胞。這樣的話耗盡靶細(xì)胞并不是所需的并認(rèn)為存在著副作用。例如，抗CD4抗體阻斷T細(xì)胞上CD4受體的能力使其能有效地抗炎，甚至它們招募Fe Y R受體的能力也可指導(dǎo)免疫 系統(tǒng)攻擊靶細(xì)胞，導(dǎo)致T細(xì)胞損耗(Reddy等·，2000，J Immunol 164:1925-1933)。對(duì)于稱為放射綴合物的放射標(biāo)記的抗體以及稱為免疫毒素的綴合毒素的抗體而言，效應(yīng)器功能也許是一道難題。這些藥物可用于破壞癌細(xì)胞，但是通過(guò)Fe與Fe Y R相互作用所招募的免疫細(xì)胞使得健康的免疫細(xì)胞接近致死性的負(fù)載物(放射物或毒素)，導(dǎo)致正常淋巴組織連同革巴癌細(xì)胞一起損耗(Hutchins 等·，1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980-11984;White等.，2001, Annu Rev Med 52:125-145)。通過(guò)使用IgG同種型有可能解決該問(wèn)題，該IgG同種型無(wú)法充分地招募補(bǔ)體或效應(yīng)細(xì)胞，例如IgG2及IgG4?？蛇x的解決方案是開(kāi)發(fā)能減少或消除結(jié)合能力的Fe變體(Alegre等· , 1994, Transplantation 57 :1537-1543 ；Hutchins 等·，1995, Proc Natl Acad Sci USA92 :11980-11984 ；Armour 等·，1999, Eur JImmunol 29 :2613-2624 ;Reddy 等·，2000，J Immunol 164 :1925-1933 ;Xu 等·，2000，CellImmunol 200 :16-26 ；Shields 等· ,2001, J Biol Chem276 :6591-6604)(US 6，194，551 ；US5, 885, 573 ；PCT WO 99/58572)。對(duì)于減少或消除效應(yīng)器功能而言，主要的考慮是其它重要的抗體特性不被干擾。應(yīng)改造Fe變體，以不僅消除與Fe Y R和/或Clq的結(jié)合，而且還能保持抗體的穩(wěn)定性、可溶性和結(jié)構(gòu)的整體性(integrity),以及能保持與諸如FcRn和蛋白A及G的其它重要Fe配體相互作用的能力。本發(fā)明解決了抗體的另一個(gè)主要缺點(diǎn)，即它們過(guò)分苛求的生產(chǎn)必備條件(Garber，2001, Nat Biotechnol 19 :184-185 ;Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777-779)。抗體應(yīng)當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，且目前市售抗體與其它高度需求的生物治療藥物基本上耗盡了所有可用的制造能力。有數(shù)百種生物制劑正在開(kāi)發(fā)中，其中大多數(shù)是抗體，迫切需要更有效及更便宜的生產(chǎn)方法。不足的抗體制造能力具有三方面的下游效應(yīng)。首先，對(duì)于生產(chǎn)者而言顯著增加了產(chǎn)品成本，即傳遞給患者的成本。其次，其阻礙了批準(zhǔn)的抗體產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)，限制了患者高度需求的治療劑的可用性。最后，因?yàn)榕R床試驗(yàn)需要大量還無(wú)利可圖的蛋白質(zhì)，所以不足的供給阻止了抗體市場(chǎng)化的成長(zhǎng)過(guò)程。已研究用于嘗試解決該問(wèn)題的可選的生產(chǎn)方法。正尋求將轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物作為可能的更便宜及更高產(chǎn)的系統(tǒng)(Chadd等.，2001, Curr Opin Biotechnol 12 :188-194)。然而，該表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生明顯不同于人糖蛋白的糖基化型(glycosylation patterns)。其可導(dǎo)致效應(yīng)器功能減少或甚至缺失，因?yàn)槿缟纤懻?，該糖結(jié)構(gòu)能顯著地影響Fe Y R和補(bǔ)體的結(jié)合。非人糖型潛在的巨大問(wèn)題可能是免疫原性；對(duì)于免疫系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，糖是抗原性的關(guān)鍵來(lái)源，并且非人糖型的存在具有相當(dāng)大的引發(fā)抗體中和治療的機(jī)率，或更嚴(yán)重地引起有害的免疫反應(yīng)。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物生產(chǎn)的抗體的療效和安全性仍無(wú)法確定。細(xì)菌表達(dá)是另一種引人注目的解決抗體生產(chǎn)難題的方案。在諸如大腸桿菌的細(xì)菌中表達(dá)提供了一種用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的節(jié)省成本和高效的方法。對(duì)于諸如抗體等復(fù)合物蛋白質(zhì)而言，在細(xì)菌表達(dá)中存在許多障礙，包括這些復(fù)合物分子的折疊和組裝、正確形成二硫鍵以及缺乏糖基化時(shí)的溶解性、穩(wěn)定性和功能性，因?yàn)樵诩?xì)菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)不被糖基化。已成功地在大腸桿菌中表達(dá)出能結(jié)合抗原的全長(zhǎng)非糖基化抗體(Simmons等.，2002, J Immunol Methods263 :133-147),因此在缺乏真核侶伴蛋白手段下，細(xì)菌性表達(dá)抗體的折疊、組裝和正確形成二硫鍵可能發(fā)生。然而，用于治療的細(xì)菌性 表達(dá)抗體的最終功效仍為缺乏糖基化而困擾，其導(dǎo)致缺乏效應(yīng)器功能并可導(dǎo)致不良的穩(wěn)定性和溶解性。對(duì)于在高濃度下需要長(zhǎng)期臨床使用的劑型而言，很可能存在更多問(wèn)題。對(duì)于上述可選的生產(chǎn)方法而言,具有有利溶解特性(solution property)以及介導(dǎo)效應(yīng)器功能的能力的非糖基化(aglycosylated)Fc將有效地使之成為可能。通過(guò)克服非糖基化Fe結(jié)構(gòu)和功能上的缺點(diǎn)，抗體可在細(xì)菌中以及轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物中生產(chǎn)，具有減少的免疫原性危險(xiǎn)，以及在需要細(xì)胞毒性的臨床應(yīng)用諸如癌癥中具有效應(yīng)器功能。本發(fā)明描述了利用蛋白質(zhì)工程方法來(lái)開(kāi)發(fā)具有效應(yīng)器功能的穩(wěn)定、可溶的Fe變體。當(dāng)前，在本領(lǐng)域中并不存在這樣的Fe變體。總之，需要具有增強(qiáng)的治療特性的抗體。設(shè)計(jì)優(yōu)化或增強(qiáng)的Fe變體是符合該需求的有前途的方法。雖然，設(shè)計(jì)具有所需特性的Fe變體的真正障礙在于預(yù)測(cè)無(wú)數(shù)可能性中的哪些氨基酸修飾可實(shí)現(xiàn)所需目的，和對(duì)于抗體而言效率低的生產(chǎn)和篩選方法。實(shí)際上，對(duì)于不完全成功的現(xiàn)有技術(shù)而言，其基本前提之一是使用類似于Fe設(shè)計(jì)的方法，因此更多地涉及諸如丙氨酸掃描的嘗試(hit-or-miss)方法或使用不同的表達(dá)菌株來(lái)產(chǎn)生糖型。在這些研究中，可進(jìn)行完全或部分隨機(jī)的Fe修飾希望能獲得具有有利特性的變體。本發(fā)明提供了多種工程方法，其中許多基于更完善和更有效的技術(shù)，可用于克服這些障礙以便開(kāi)發(fā)對(duì)于所需特性優(yōu)化的Fe變體。所述的工程方法提供了指導(dǎo)Fe修飾的設(shè)計(jì)策略、用于設(shè)計(jì)有利Fe變體的計(jì)算篩選方法、用于確定對(duì)試驗(yàn)研究有用的變體的文庫(kù)產(chǎn)生方法以及用于確定具有有利特性Fe變體的一系實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)和篩選方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了 Fe變體，其許多與治療相關(guān)的特性得到優(yōu)化。這些Fe變體通常包含在變體蛋白質(zhì)中，所述變體蛋白質(zhì)優(yōu)選包含抗體或Fe融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的Fe位置，在該位置上氨基酸修飾可用于產(chǎn)生優(yōu)化的 Fe 變體。所述 Fe 位置包括 230、240、244、245、247、262、263、266、273、275、299、302、313、323、325、328和332，其中Fe區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。本發(fā)明描述在任一所述新的Fe位置上的任何氨基酸修飾，以便產(chǎn)生優(yōu)化的Fe變體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供計(jì)算篩選的Fe變體。計(jì)算篩選的Fe變體是一種通過(guò)在本文中所描述的計(jì)算篩選計(jì)算所預(yù)測(cè)的變體，對(duì)于優(yōu)化所需特性而言，計(jì)算篩選較隨機(jī)方法具有更有效的潛力?？梢?jiàn)，計(jì)算篩選可作為試驗(yàn)篩選的先用品(prelude)或替代品，因此所述的計(jì)算篩選的Fe變體被認(rèn)為是新的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用一種或多種本文所述的實(shí)驗(yàn)方法鑒定的Fe變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fe變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自230，233，234，235，239，240，241，243，244，245，247，262，263，264，265，266，267，269，270，272，273，274，275，276，278，283，296，297，298，299，302，313，318，320，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，或 335，其中 Fe 區(qū)中殘基編號(hào)方式是 Kabat 的 EU 標(biāo)引方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fe變體包含至少一種氨基酸取代，選自221，222，224，227，228，230，231，223，233，234，235，236，237，238，239，240，241，243，244，245，246，247，249，250，258，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，278，280，281，283，285，286，288，290，291，293，294，295，296，297，298，299，300，302，313，317，318，320，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335 336 和 428，，其中Fe區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式 。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fe變體包含至少一種選自下組的取代P230A，E233D, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H,L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I,L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A,V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L F243Y, F243R, F243Q,P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M,V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q,D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q,S267L, S267T, S267H, S267D, S267N, E269H, E269Y, E269F, E269R, E269T, E269L, E269N,D270Q, D270T, D270H, E272S, E272K, E272I, E272Y, V273I, K274T, K274E, K274R, K274L,K274Y, F275W, N276S, N276E, N276R, N276L, N276Y, Y278T, Y278E, Y278K, Y278W, E283R,Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E,A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, V302I, W313F, E318R,K320T, K320D, K320I, K322T, K322H, V323I, S324T, S324D, S324R, S324I, S324V, S324L,S324Y, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, K326L, K326I,K326T, A327N, A327L, A327D, A327T, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I,L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, A330Y, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H,A330S, A330W, A330M, P331V, P331H, I332D, I332E, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y,I332A, E333T, E333H, E333I, E333Y, K334I, K334T, K334F, T335D, T335R 和 T335Y，其中 Fe區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式。在最為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fe變體選自V264L，V264I, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W,F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V264I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, I332E, L328M/I332E, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, V264I/I332E, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q,T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, I332D, N297S,N297D, N297S/I332E, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D265F/N297E/I332E, L328I/I332E, L328Q/I332E, I332N, I332Q, V264T,V264F, V240I, V263I, V266I, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N325I, S239D, S239N,S239F, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332D, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Y296N, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234D,L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N,L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239T, S239H, S239Y, V240A, V240T,V240M, V263A, V263T, V263M, V264M, V264Y, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F,E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, A298H, T299H, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H,N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, L328D/I332E, L328E/I332E, L328N/I332E,L328Q/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328H/I332E, L328I/I332E, L328A, I332T,I332H, I332Y, I332A, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E,S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E,S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E,S239D/D265T/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296D/N297D/I332E, Y296E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, Y296Q/N297D/I332E, Y296H/N297D/I332E, Y296T/N297D/I332E, N297D/T299V/I332E, N297D/T299I/I332E, N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E, N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E, L328N, L328H,S239D/I332E/A330I, N297D/I332E/S239D/A330L, P230A, E233D, P230A/E233D, P230A/E233D/I332E, S267T, S267H, S267D, S267N, E269T, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H,E272S, E272K, E272I, E272Y, V273I, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276S,N276E, N276R, N276L, N276Y, Y278T, Y278E, Y278K, Y278W, E283R, V302I, E318R, K320T,K320D, K320I, K322T, K322H, V323I, S324T, S324D, S324R, S324I, S324V, S324L, S324Y,K326L, K326I, K326T, A327D, A327T, A330S, A330W, A330M, P331V, P331H, E333T, E333H,E333I, E333Y, K334I, K334T, K334F, T335D, T335R, T335Y, L234I/L235D, V240I/V266I,S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I,S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/V266I, S239D/A330Y/I332E/K326E,S239D/A330Y/I332E/K326T, S239D/N297D/I332E/A330Y, S239D/N297D/I332E/A330Y/F241S/F243H/V262T/V264T, S239D/N297D/I332E/L235D,和 S239D/N297D/I332E/K326E，其中Fe區(qū)中殘基編號(hào)方式是Kabat的EU標(biāo)引方式 本發(fā)明另一目的是提供Fe變體，其選自D221K, D221Y，K222E，K222Y，T223E，T223K,H224E,H224Y,T225E,T225,T225K,T225W,P227E,P227K,P227Y,P227G,P228E,P228K,P228Y, P228G, P230E, P230Y, P230G, A231E, A231K, A231Y, A231P, A231G, P232E, P232K,P232Y, P232G, E233N, E233Q, E233K, E233R, E233S, E233T, E233H, E233A, E233V, E233L,E233I, E233F, E233M, E233Y, E233W, E233G, L234K, L234R, L234S, L234A, L234M, L234W,L234P, L234G, L235E, L235K, L235R, L235A, L235M, L235W, L235P, L235G, G236D, G236E,
權(quán)利要求
1.變體蛋白質(zhì)，包含野生型Fe多肽的Fe變體，所述Fe變體包含位于所述野生型Fe多肽的Fe區(qū)中的至少一種氨基酸修飾，其中所述變體多肽與Fe Y R的結(jié)合與野生型Fe多肽相比有所改變。
2.權(quán)利要求I的變體蛋白質(zhì)，其中所述Fe變體包含至少一種位于以下位置的取代，所述位置對(duì)應(yīng)選自下組的 Fe 位置230, 240，244，245，247，262，263，266，273，275，299，302，313，323，325，328，或 332。
3.權(quán)利要求I的變體蛋白質(zhì)，其中所述改變的結(jié)合為所述Fe變體與所述FeY R的親和力增加。
4.變體蛋白質(zhì),其包含野生型Fe多肽的Fe變體，所述Fe變體包含至少一種位于所述 野生型Fe多肽的Fe區(qū)中的氨基酸修飾，其中所述Fe變體與親代Fe多肽相比調(diào)節(jié)效應(yīng)物功能。
5.權(quán)利要求4的變體蛋白質(zhì)，其中所述效應(yīng)物功能是ADCC。
6.權(quán)利要求5的變體蛋白質(zhì)，其中所述Fe變體與野生型Fe多肽相比在人效應(yīng)細(xì)胞存在下增強(qiáng)ADCC。
7.權(quán)利要求I的變體蛋白質(zhì)，其對(duì)靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自CD20，CD22，CD33，CD52，Her2/neu, EGFR, EpCAM, MUCl，⑶3，CEA, CA125, HLA-DR，TNFalpha,和 VEGF 組成的組。
8.權(quán)利要求I或4的變體蛋白質(zhì)，包括選自以下修飾組成的組的修飾239D，239E，239N,239Q,239T,2401,240M,2641，264T，264Y,297D,3301,330L,330Y,332D,332E,332N,332Q,A231E，A231G，A231K,A231P，A231Y，A298H,A327D,A327E,A327F,A327H,A327I，A327K,A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327T, A327T, A327V, A327W, A327Y, A330E, A330F,A330F, A330G, A330H, A330I, A330L, A330L/I332E, A330M, A330N, A330P, A330R, A330S,A330T, A330V, A330W, A330Y, A330Y, A330Y/I332E, D221K, D221Y, D249H, D249Q, D249Y,D265F, D265F/N297E/I332E, D265G, D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P,D265Q, D265R, D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S,D270T, D270W, D270Y, D280G, D280H, D280K, D280L, D280P, D280Q, D280W, D280Y, E233A,E233D, E233F, E233G, E233H, E233I, E233K, E233L, E233M, E233N, E233Q, E233R, E233S,E233T, E233V, E233W, E233Y, E258H, E258S, E258Y, E269F, E269G, E269H, E269I, E269K,E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, E272D, E272F,E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W,E272Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P, E283R, E283Y, E293F, E293G, E293H, E293I,E293L, E293M, E293N, E293P, E293R, E293S, E293T, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G,E294H, E294I, E294K, E294L, E294M, E294N, E294P, E294R, E294S, E294T, E294V, E294W,E294Y, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, E333A, E333F, E333H, E333I, E333L, E333M,E333P, E333S, E333T, E333Y, E333Y, F241D, F241E, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, F241L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241L/V262I, F241R, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241R/F243Q/biQTCCd iWTCCd iITCCd iITCCd iHTCCd iHTCCd iHTCCd iQlZZd‘I6ZSd ‘A6ZSd iXeCCd‘S6ZSd ‘H6ZSd iQeCCd ‘N6ZSd ‘W6ZSd ‘16ZSd iWZZd iIGZZd iEGZZd ‘36ZSd ‘H6ZSd ‘H6ZSd'mzzd ‘a(chǎn)6zsd ‘U62d iQiecd ‘n6Zd iHiecd ‘iH6Zd ‘3T6Zd ‘<n6Zd iAizcd iIizcd iAizcdiXTZCd iSTZCd iHTZCd iQTZCd iNTZCd iWTZCd irIlLZd iJlLZd iIlLZd iHTZCd iOTZCd iHTZCdiHTZCd iOTZCd iVTZCd iAZ^Cd iOZ^d ‘VS城d 'ALfZd/YSfZd/EffZd iH^Cd iASCCd iISCCdiASCCd iXSCCd iSSCCd iHSCCd iQSCCd iNSCCd iWSCCd iISCCd 4)I8CCd iISCCd iHSCCd iOSCCdiHSCCd ‘38SZd iQSZZd iKZZZd i^CCd iOCCCd iHCCCd iAOCCd iOOCCd iHOCCd ^ZZZI/QZZZ^/Yozzd Occca/voccd iVoccd iAsccd iWCd iOszzd ‘38Hd iKizzd i^Lzzd Ozccd i^izzdiASCCN iISCCN iASCCN iXSCCN iSSCCN iHSCCN iQSCCN iQSCCN MSCCN iWSCCN iISCCN iMSCCNiISCCN iHSCCN iOSCCN iHSCCN iHSCCN iOSCCN iVSCCN Ζ62Ν Ζ62Ν ΖβΖΝ ΖβΖΝ iHCCCI/SZ6CN 4SZ6CN 4SZ6CN Ζ62Ν ‘δΖ6ΖΝ MZ6CN Ζ62Ν Ζ62Ν 4)ΙΖ62Ν Ζ62Ν Ζ62Ν Ζ62Ν Ζ62Ν ‘3Ζεε /3Ζ6ΖΝ ‘似6ΖΝ i^ZZZI/Α66ΖΙ/(116ΖΗ ^ΖζΖΙ/166ΖΙ/(116ΖΗ *32221/16621/QL6ZH ‘3Ζεε /Η66Ζ1/αΖ6ΖΝ i^ZZZI/d66ZI/QL6ZH ‘3Ζεε /366Ζ1/αΖ6ΖΝ ^CCCI/AOCCV/V86cs/az62N οεεν/αβεζε/Ξζεει/αζβΖΝ ^ζεει/αζβ^Ν ^ζεει/λοεεν/αζβ^Ν ζθζν 982Ν M98CN 982Ν ‘398ΖΝ 9Ζ2Ν 9Ζ2Ν ‘艦ZN 9Ζ2Ν 9Ζ2Ν ‘S9UN ‘艦ZN M9ZCN‘麗ZN 9Ζ2Ν 9Ζ2Ν 9Ζ2Ν 9Ζ2Ν ‘觀ZN ‘39UN ΘΖΖΝ iISZfW dSZflfiiASZZl^ZZZI/ASZZl iASZZl *32221/18221 *18221 iSSCCl*32221/58221 *58221 *58221Μ8^ει ‘3ζεει/Ν8ζε iNscci i^zzziZmzzi iWzzi ‘)κζε ^ccci/iscci iIscci ιζεει /Η8ζει ‘Η8ζε ‘置ει iHscci ^ccci/ascci ‘38ζε ^zzzi/qszzi iQszzi iYszzi iAscciiISCCl iASCCl iXSCCl iSSCCl iHSCCl iQSCCl MSCCl iNSCCl iWSCCl iMSCCl iISCCl iHSCCliOSCCl iHSCCl iHSCCl iHSCCl iQSZZl iYSZZl iKfZZl iAfZZl iAfZZl iX^CCl iS^CCl ‘肌Ζ iQfzzi ‘辦εη ‘·εη iWUZi i^cci iQszzVmzi iI^cci ‘ι^ζ ‘η^ζ iOfzzi ‘辦εη‘邪εη iQfzzi iYfzzi ‘ι^εε) Μ^εοι ^εοι i^coi ‘邪εε) iYfzzi θζοι 'mzzi θζοι*19201 ‘S9ZS)I *59201 Μ92δ)Ι ‘N9ZS)I *19201 *19201 *19201 *09201 ΘΖΟΙ iHSCOI iKZZZJiAZZZJ iAZZZJ iXCCOI iSCCOI MCCOI iICCOI iHCCOI iOZZZJ iHCCOI iQZZZJ iAOCOI iIOCOIiAOCOI iXOCOI iXOCOI iSOCOI MOCOI iNOCOI iIOCOI iIOCOI iHOCOI iOOCOI iHOCOI ΟΖΟΙiQZTOI iHZTOI ΟβΖ)! 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S337N,T223E,T223K,T225,T225E,T225K,T225W,T250E, T250Q, T260D, T260E, T260H, T260Y, T299A, T299D, T299E, T299F, T299G, T299H,T299I, T299K, T299L, T299L, T299M, T299N, T299P, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W,T299Y, T335D, T335F, T335G, T335H, T335I, T335L, T335M, T335N, T335P, T335R, T335S,T335V, T335W, T335Y, V240A, V240I, V240I/V266I, V240M, V240T, V262A, V262E, V262F,V262I, V262T, V263A, V263I, V263M, V263T, V264D, V264E, V264E/N297D/I332E, V264F,V264G, V264H, V264I, V264I/A330L/I332E, V264I/A330Y/I332E, V264I/I332E, V264I/S298A/I332E, V264K, V264L, V264M, V264N, V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W,V264Y, V266A, V266I, V266M, V266T, V266T, V273I, V273I, V282E, V282G, V282K, V282P,V282Y, V284E, V284L, V284N, V284T, V284Y, V302I, V302I, V303D, V303E, V303Y, V305E,V305T, V305Y, V323I, V323I, W313F, Y278D, Y278E, Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L,Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, Y296A, Y296D, Y296D/N297D/I332E, Y296E, Y296E/N297D/I332E, Y296G, Y296H, Y296H/N297D/I332E, Y296I,Y296K, Y296L, Y296M, Y296N, Y296N/N297D/I332E, Y296Q, Y296Q/N297D/I332E, Y296R,Y296S, Y296T, Y296T/N297D/I332E, Y296V, Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300I,Y300K, Y300L, Y300M, Y300N, Y300P, Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V，和 Y300W。
9.藥物組合物，其包含權(quán)利要求I的變體蛋白質(zhì)以及可藥用的載體。
10.治療需要所述治療的哺乳動(dòng)物的方法，包括給藥權(quán)利要求I的變體蛋白質(zhì)
全文摘要
本申請(qǐng)涉及優(yōu)化的Fc變體及其產(chǎn)生方法。本發(fā)明涉及優(yōu)化的Fc變體、產(chǎn)生它們的方法、以及包含優(yōu)化的Fc變體的抗體和Fc融合體。具體而言，本申請(qǐng)涉及變體蛋白質(zhì)，其包含野生型Fc多肽的Fc變體，所述Fc變體包含位于所述野生型Fc多肽的Fc區(qū)中的至少一種氨基酸修飾，其中所述變體多肽與FcγR的結(jié)合與野生型Fc多肽相比有所改變。更具體地，所述Fc變體包含至少一種位于以下位置的取代，所述位置對(duì)應(yīng)選自下組的Fc位置230,240,244,245,247,262,263,266,273,275,299,302,313,323,325,328,或332。
文檔編號(hào)C07K16/32GK102633880SQ20121005779
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月2日
發(fā)明者黨偉, 奧米德.瓦法, 希爾.B.卡基, 斯蒂芬.K.多伯斯坦, 格雷戈里.A.拉扎爾, 約翰.R.德斯加爾萊斯, 羅伯特.J.海斯, 阿瑟.J.奇里諾 申請(qǐng)人:贊科股份有限公司