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改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制備方法與用圖

文檔序號:8453517閱讀:1569來源:國知局
改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制備方法與用圖
【專利說明】改良型人凝血因子FVI l-Fc融合蛋白及其制備方法與用途
[0001] 本發(fā)明為分案申請,其原申請的申請?zhí)枮?01310357373.X,申請日為2013年8月 16日,發(fā)明名稱為"改良型人凝血因子FVII-化融合蛋白及其制備方法與用途"。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及一種改良型人凝血因子FVII的化融合蛋白及其制備方法和用途,特 別是治療多種凝血相關(guān)疾病的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 凝血是由多種血液組分(或因子)之間復(fù)雜的相互作用組成的逐漸導(dǎo)致纖維蛋白 凝塊形成的過程,通常參與被稱為凝血"級聯(lián)反應(yīng)"的血液組分是原酶或酶原,即不具有酶 活性的蛋白,在激活劑的作用下使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦?。凝血因子FVII就是該些凝血因子中的 一種。
[0004] FVII是一種維生素K依賴性的血漿糖蛋白,在肝臟中合成,并W分子量約為53 邸a的單鏈蛋白酶原形式分泌到血液中(化oze等,/公如7。細?,1980,255: 1242-1247)。 FVII酶原在單一位點Argl52-Ilel53處被蛋白酶水解,產(chǎn)生由一個二硫鍵連接的雙鏈,從 而轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚孕问紽VIIa。單鏈凝血因子FVII可W通過凝血因子巧a、凝血因子巧Ila 、凝血因子FIXa、凝血因子FVIIa或凝血酶在體外水解轉(zhuǎn)化為雙鏈凝血因子FVIIa。活化的 FVIIa包含N&-末端衍生的輕鏈(~20邸a)和C00H-末端衍生的經(jīng)由單一二硫鍵(切S135 至切S262)連接的重鏈(~30KDa)。輕鏈含有細胞膜結(jié)合性Gla結(jié)構(gòu)域和兩個EGF結(jié)合結(jié) 構(gòu)域,而重鏈含有催化結(jié)構(gòu)域。處于活化形式時,F(xiàn)VIIa作為絲氨酸蛋白酶,參與凝血級聯(lián) 反應(yīng)的外源性途徑(extrinsicpathway)。當血管的脈管內(nèi)腔受損傷時,外源性凝血路徑被 啟動,細胞膜糖蛋白組織因子(TissueFactor,TF)被暴露,結(jié)合循環(huán)性的FVII和已存在 的較小量活化FVIIa,該種結(jié)合促進FVII全部轉(zhuǎn)化為FVIIa,隨后在巧離子和磯脂的協(xié)同作 用下,使FIX轉(zhuǎn)化為FIXaJX轉(zhuǎn)化為巧a,繼而進一步將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶。凝血酶在 血液凝固和傷口愈合方面起關(guān)鍵作用,在血管損傷的最初階段,其誘導(dǎo)血小板聚集并誘導(dǎo) 纖維蛋白形成,之后刺激細胞生長從而促進受損血管的修復(fù)(Osterud等,化(9C化 5bi必劇,1977,74: 5260-5264)。
[0005] 編碼人FVII化FVII)的基因位于13號染色體的q34-qter9, 9個外顯子組成,長 度為 12. 8 肺(0,Kara等,#別7 5bi似4 1987,84: 5158-5162)。hFVII包 含四個結(jié)構(gòu)域:氨基端丫-駿基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)域,兩個"類表皮生長因子(EGF)"結(jié)構(gòu) 域和駿基端絲氨酸蛋白酶域(催化結(jié)構(gòu)域)。外顯子la和Ib編碼信號膚序列;外顯子2編 碼Gla結(jié)構(gòu)域;外顯子3編碼一段短的疏水區(qū);外顯子4和5編碼類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域; 外顯子6至8編碼絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域(Yoshitake等,公化7, 1985, 24: 3736-3750)。成熟FVII蛋白經(jīng)歷多種翻譯后修飾,包括維生素K依賴性的駿基化,導(dǎo)致該 分子N肥-末端產(chǎn)生10個丫駿基化的谷氨酸殘基。其他翻譯后修飾包括哲基化(Asp63)、 N-型糖基化(Asnl45和Asn322)W及0-型糖基化(Ser52和Ser60)。
[0006] 血友病A和B是遺傳性疾病,分別是凝血因子FVIII和凝血因子FIX的缺陷而 造成的。蛋白替代療法是血友病A和B的傳統(tǒng)治療方法,包括靜脈內(nèi)給予從人血漿中制備 的或基因工程方法獲得的重組FVIII或FIX。然而,在血友病A和B的治療中,存在最嚴重 的醫(yī)學(xué)問題是針對替代凝血因子的同種抗體(alloantibody)的產(chǎn)生,該導(dǎo)致治療效力降低 或者使治療無效。所有血友病A患者中產(chǎn)生針對凝血因子FVIII抗體高達30%,而針對血 友病B產(chǎn)生凝血因子FIX抗體發(fā)生幾率較小,但具有更嚴重的后果,因為它們對免疫耐受性 誘導(dǎo)療法較不敏感。在血友病治療中使用FVIIa是基于FVIIa對于凝血酶活化的血小板 表面的低親和性結(jié)合,通過給予藥物學(xué)劑量的外源性FVIIa,使損傷位處血小板表面上的凝 血酶產(chǎn)生被增強,該與FVIII/FIX的存在無關(guān),即繞開對于凝血因子Villa和凝血因子IXa 的需求來達到止血。因此,F(xiàn)VIIa可用于存在有抑制物的血友病患者的出血性狀況的治療。 FVIIa還被用于治療先天性FVII缺陷的患者。另外,F(xiàn)VIIa越來越多地被用做適應(yīng)癥外使 用(off-lableuse),如治療與非血友病患者中先天性或獲得性出血性疾病,外傷或手術(shù)相 關(guān)的出血。
[0007] 鑒于血漿FVII的來源有限,且伴有病毒感染的風(fēng)險。重組FVII已成為研發(fā)重點 之一。有報道FVII在BHK細胞或其它哺乳動物細胞中的有效表達(W09215686,W09111514, W08810295 ),并在純化過程中將其轉(zhuǎn)變成活化的FVIIa。專利FR0604872還描述了利用 轉(zhuǎn)基因動物制備FVIIa的方法。市售的重組凝血因子FVIIa目前只有NovoSeven? (Novo Nordisk,丹麥)。該藥已在全世界范圍內(nèi)被批準用于治療具有因產(chǎn)生FVIII或FIX抗體(抑 制劑)的血友病A或B患者,先天性FVII缺陷的患者和終止與外傷和/或手術(shù)相關(guān)的出血 事件或預(yù)防出血。
[0008] 治療性凝血蛋白藥物包括FVIIa在內(nèi)會被蛋白水解酶快速降解,并且易被抗體中 和,該會降低它們的半衰期和體內(nèi)循環(huán)時間,由此限制了它們的療效。在"SummaryBasis forApprovalNovoSeven?"(抑A參考號96-0597)中報道了重組FVIIa在人體內(nèi)循環(huán)半衰 期為2. 3小時,而相對高的劑量和頻繁給藥對于達到并維持期望的療效和預(yù)防效果是必須 的,該導(dǎo)致極高的治療成本W(wǎng)及患者治療的不便。迄今,還沒有商品化的具有延長血漿半衰 期的重組FVIIa。由于凝血因子FVII/VIIa具有作為通用止血劑的潛能,因此仍然存在開 發(fā)具有更長的體內(nèi)功能半衰期(化nctionalhalf-life)FVII的臨床需求。目前有多種策 略應(yīng)用于改善FVII藥動學(xué)特性,延長其體內(nèi)半衰期。如與脂類或PEG結(jié)合。NovoNordisk 公司正在開發(fā)的糖聚己醇二醇化FVIIa(參見專利US20050113565和US8053410)和PCT申 請W02008074032還提及一種具有延長體內(nèi)半衰期的FVIIa-聚唾液酸結(jié)合物。此外,已公 開的其它方法還有增加糖基化位點,比如Bayer公司正在開發(fā)的高糖基化FVIIa,T106N和 V253N點突變(參見專利US20060252128、EP1549677B和US20100260741)或CSLBe虹ing 公司正在開發(fā)的FVIIa-白蛋白融合蛋白(參見專利W02007090584)。美國ProlorBiotech 公司正在開發(fā)的一種長效凝血因子FVII,將hCG的駿基膚(Carbo巧-terminal,CTP)連接至 凝血因子FVII的駿基端獲得了具有延長半衰期的FVII(參見專利US20100317585)。
[0009]IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)。它們的半衰期可高達21 天,而Fc片段是IgG保持體內(nèi)較長半衰期的主要原因,同時具有穩(wěn)定蛋白的作用。大量 研究已證實IgG的Fc片段與活性蛋白連接構(gòu)成融合蛋白,可W提高活性蛋白的體內(nèi)半衰 期,該種方法已被用于一些臨床上很重要的細胞因子巧日EPO-Fc,GCSF-Fc,IL2-FC,和 IFNa2a-Fc)和可溶性受體巧日TNFR-Fc,VEGFR-Fc,LFA3-化和CTLA4-FC),化融合蛋白 在體內(nèi)半衰期都有不同程度的延長(美國專利No. 5349053和6224867)。天然原型或改造 的雙頭同源二聚體化融合蛋白是通過IgG化絞鏈區(qū)中的半脫氨酸殘基連接的形成類似于 IgG分子但無CH1區(qū)域和輕鏈。由于結(jié)構(gòu)上的同源,化融合蛋白表現(xiàn)出與類似同亞型人IgG 相當?shù)捏w外藥物動力學(xué)特性,目前已經(jīng)上市的化融合蛋白都是該種類型的。另外,Biogen Idee公司最近幾年開發(fā)的單頭二聚體化融合蛋白是化二聚體一端含有融合的目標蛋白, 另一端是不含任何目標蛋白的空白,該種方法主要針對W下兩種情況;一是那些待表達的 目標蛋白的重組表達難度很高,雙頭同源二聚體化融合的正確折疊和分泌效率低;二是目 標分子很大,雙頭同源二聚體化融合可能產(chǎn)生=維結(jié)構(gòu)的空間位阻而影響目標蛋白的功 能發(fā)揮。目前單頭二聚體化融合方法已經(jīng)應(yīng)用于凝血因子FVIII、FIXW及FVII,W期實現(xiàn) 在C冊細胞內(nèi)的高效重組表達,同時具有延長的體內(nèi)半衰期,其中單頭二聚體FVIII-FcW 及FIX-化融合蛋白均已進入臨床研究階段,并分別在W02011069164A2和專利EP1624891B1 中進行了公開,而同時歐洲專利EP1624891B1也公開了單頭二聚體FVII與化的融合形式。
[0010] 針對W上現(xiàn)有技術(shù)中所述有關(guān)同源二聚體化融合FVII的制備的困難及其在臨 床應(yīng)用過程中存在的局限,如表達量不高、半衰期短W及穩(wěn)定性差等,本領(lǐng)域迫切需要開發(fā) 長效、穩(wěn)定性好且可WW合理的成本生產(chǎn)的FVII衍生物。由于hFVII-L-v化融合蛋白的 構(gòu)建有其本質(zhì)上的困難,迄今為止尚沒有獲得具有半衰期顯著延長且可穩(wěn)定高效表
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