鄰苯二甲酸二(α-乙基己)酯半抗原、人工抗原及其抗體制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全領域，更具體的說，本發(fā)明涉及鄰苯二甲酸二（α-乙基己） 酯半抗原合成、人工抗原和抗體制備，還涉及上述鄰苯二甲酸二（α-乙基己）酯半抗原及 其相應的人工抗原和抗體的制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 鄰苯二甲酸二（α -乙基己）酯（Di (2-ethylhexyl) phthalate)，英文縮寫 DEHP, 又名鄰苯二甲酸二辛酯，分子量為390. 5, 25°C時該品在水中溶解度〈0.01%，溶于大多數 有機溶劑和烴類，其結構式為：
[0003]
【主權項】
1. 一種DEHP半抗原，其特征在于，分子結構式為：
η為4或5〇
2. -種DEHP人工抗原，是由權利要求1所述的DEHP半抗原與載體蛋白結合而成，其特 征在于：所述DEHP人工抗原分子結構式為：
η為4或5 ;所述的載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)。
3. -種DEHP抗體，是能與權利要求2所述的DEHP人工抗原發(fā)生特異性免疫反應的免 疫球蛋白。
4. 如權利要求1所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于包括以下步驟： (1)按投料比為2:1~3:1將濃硝酸與DEHP置于圓底燒瓶中，冰浴條件下滴加到2倍 于濃硝酸量的濃硫酸中，磁力攪拌，反應至室溫，再60°C回流反應5h，期間用TLC監(jiān)控。用 lm〇L/L的氫氧化鈉溶液中和反應液至弱堿性，乙酸乙酯萃取3次，有機相于旋轉蒸發(fā)儀上 減壓蒸干得到粗的硝化產物DEHP-NO 2，過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為2:1~3:1的氯仿/ 環(huán)己烷洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到純化的硝化產物DEHP-NO 2 ; ⑵按投料比為1:3:3將DEHP-N02、NH4CU鐵粉置于圓底燒瓶中，添加到適量的70% 乙醇溶液中，磁力攪拌，50°C回流反應5h，期間用TLC監(jiān)控；反應結束后，向反應液中加入 IOOmL無水乙醇，濾去鐵粉，收集濾液，于旋轉蒸發(fā)儀濃縮近干；向濃縮液中加30mL水，用乙 酸乙酯萃取3次，收集有機相，蒸干，得到粗產物DEHP-NH 2 ;過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為 5:1~4:1的氯仿/甲醇洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到純化的還原產物DEHP-NH 2 ; (3)將0.1 mmoL純化的DEHP-NH2與0. 15mmoL酸酐于無水吡啶中40°C攪拌反應過夜， 反應液旋轉蒸發(fā)儀濃縮得到黏稠液體，過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為6:1~4:1的氯仿/ 甲醇洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到產物即為DEHP半抗原。
5. 如權利要求4所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于：濃硝酸為65 %的硝酸，酸 酐為丁二酸酐或戊二酸酐。
6. 權利要求2所述DEHP人工抗原的制備方法為活潑脂法與混合酸酐法，其特征在于： 所述活潑酯方法為： (1) 將0.1 mmol的DEHP半抗原溶解于ImL的DMF中，然后在該溶液里加入等摩爾的DCC 和NHS，室溫避光反應過夜； (2) 4°C離心去除沉淀，取上清液，并將其緩慢加入到5mL pH9. 5的碳酸緩沖液中，其緩 沖液含有載體蛋白BSA或OVA，其中載體蛋白的濃度為10~15mg/mL，在4°C下反應過夜； (3)將步驟（2)中的反應液裝入透析袋，用0.9%的生理鹽水透析3d，得到人工抗原； 所述混合酸酐法為： (1) 將0.1 mmol DEHP半抗原溶于ImL DMF中，加入80 μ L正三丁胺，冰浴下緩慢滴加 0. 15mmol氯甲酸異丁酯，4°C攪拌反應Ih,此為甲液； (2) 將60mg載體蛋白BSA或OVA溶于5mLlmol/L pH9. 6的碳酸氫鈉緩沖液中，此為乙 液； (3) 將甲液緩慢滴加到乙液中，4°C磁力攪拌反應過夜，待反應完成后，裝入透析袋，然 后用0. 9 %的生理鹽水透析3d，得到人工抗原。
7. 如權利要求3所述DEHP抗體的制備方法，其特征在于： (1) 實驗選用2個月左右的健康雌性的Balb/c小鼠或新西蘭兔作為實驗對象，免疫劑 量基礎免疫為0. 25~lmg/Kg，加強免疫的劑量為0. 5~lmg/Kg。采用背部皮下多點注射， 每隔15d加強免疫一次，第4次免疫后8~10天內，靜脈采血，測定效價和特異性，待其血清 效價和特異性合格后，兔子采用心臟采血，分離出抗血清；或用小鼠脾細胞進行細胞融合， 獲得雜交瘤細胞，進而獲得單克隆抗體； (2) 采用辛酸-硫酸銨法或Protein G/A親和層析純化，得到兔抗血清或小鼠腹水中的 免疫球蛋白，即使DEHP抗體。
8. 如權利要求3所述的DEHP抗體用于制備檢測鄰苯二甲酸二（α-乙基己）酯在食品 中的殘留量的免疫檢測劑的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開鄰苯二甲酸二(α-乙基己)酯(英文縮寫DEHP)半抗原、人工抗原和抗體制備及應用，屬于食品安全領域。本發(fā)明中以DEHP為原料，經硝化反應和還原反應，制得帶氨基基團的中間產物，再與丁二酸酐、戊二酸酐等試劑反應生成帶羧基基團的半抗原；然后通過活潑脂法或者混合酸酐法與蛋白質偶聯(lián)制備人工抗原。將人工抗原免疫動物后產生對DEHP的特異性抗體。用該抗體建立免疫檢測可用于DEHP的現(xiàn)場快速檢測，對實現(xiàn)食品安全的快速檢測具有重要現(xiàn)實意義。
【IPC分類】G01N33-53, C07C239-20, C07K16-44, C07K14-77, C07K14-765, C07C233-54, C07C231-02
【公開號】CN104744294
【申請?zhí)枴緾N201410336370
【發(fā)明人】張挺, 譚龍飛, 江津津, 彭述輝, 黎海彬
【申請人】廣州城市職業(yè)學院
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2014年7月15日