分子印跡技術(shù)吸附鄰苯二甲酸二乙基己酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于分子印跡技術(shù)的食品安全控制與分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品安全是當(dāng)今世界備受人們關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。我國(guó)經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展的同時(shí)， 食品安全問(wèn)題也頻頻發(fā)生，人們由過(guò)去的吃的飽轉(zhuǎn)向關(guān)注吃的健康、科學(xué)、營(yíng)養(yǎng)?？傮w來(lái)說(shuō)， 我國(guó)的食品安全現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，從2008年的三鹿奶粉事件到后來(lái)的蘇丹紅、瘦肉精、地溝 油，這些都嚴(yán)重影響了人們的身體健康和生命安全，同時(shí)也給經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展帶 來(lái)了不利的影響。加強(qiáng)食品安全管理，改善食品安全現(xiàn)狀，減少食品安全相關(guān)事故已經(jīng)成為 了消費(fèi)者的迫切需求和政府工作的重心之一。國(guó)務(wù)院印發(fā)的《2015年食品安全重點(diǎn)工作安 排》立足于找問(wèn)題，抓改革，出實(shí)招，切實(shí)打造食品安全新常態(tài)。
[0003] 鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)是一類(lèi)常見(jiàn)的增塑劑，能夠起到軟化聚合物，改善 透明度，增強(qiáng)塑料制品耐用度的效果，因而被廣泛應(yīng)用于塑料制品的生產(chǎn)。由于成本低廉， 近年來(lái)一些廠家將其濫用在食品、醫(yī)療器械、玩具等包裝中。然而，DEHP本身具有較強(qiáng)的脂 溶性，容易從塑料制品中迀移出來(lái)，從而污染被包裝物品。并且通過(guò)呼吸、飲食和皮膚接觸 進(jìn)入人體內(nèi)，對(duì)人體健康帶來(lái)了危害。大量的動(dòng)物毒理學(xué)試驗(yàn)證明，DEHP及其代謝產(chǎn)物具 有一定的致畸性、致癌性、生殖發(fā)育毒性。由于它的潛在毒性，歐盟限制其應(yīng)用于0~3歲 兒童相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)中。FDA規(guī)定的成人每日最大攝入量為3. 5 μ g/mL，新生兒與嬰兒為 〇·3 μ g/mL〇
[0004] 分子印跡技術(shù)（MIT)是一項(xiàng)具有特異識(shí)別功能的新興技術(shù)，結(jié)合了高分子化學(xué)、 材料化學(xué)、化學(xué)工程以及生物化學(xué)等學(xué)科的知識(shí)，廣泛應(yīng)用于固相萃取、色譜分離、傳感器 制造等領(lǐng)域。它利用分子印跡聚合物（MIPs)模擬酶-底物或抗體-抗原之間的相互作用， 對(duì)印跡分子進(jìn)行專(zhuān)一性的識(shí)別。該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用成功的關(guān)鍵是MIPs的制備過(guò)程，包括功能單 體、交聯(lián)劑、溶劑、引發(fā)劑等的選擇及用量，引發(fā)聚合的條件及制備方法等。MIT以其高親和 性、高特異性、高準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，迅速吸引了各國(guó)研宄人員的關(guān)注，其應(yīng)用方 法也日趨成熟。
[0005] 目前現(xiàn)有的采用分子印跡技術(shù)（MIT)吸附鄰苯二甲酸二乙基己酯殘留的方法為： 2012年Shaikh等人用甲基丙烯酸（MAA)制備分子印跡膜富集河水中的DEHP，氣相色譜法 測(cè)定殘留量。
[0006] 目前現(xiàn)有的米用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography\ HPLC)測(cè)定鄰苯二甲酸二乙基己醋殘留的方法為：2009年Chaudhary等人建立了 HPLC測(cè)定 DEHP的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種分子印跡技術(shù)與HPLC聯(lián)用測(cè)定鄰苯二甲酸 二乙基己酯殘留的方法以及所用的烯丙基-β-環(huán)糊精分子印跡聚合物；采用本發(fā)明的方 法能從復(fù)雜化合物中分離與富集DEHP。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種烯丙基-β_環(huán)糊精分子印跡聚 合物的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)、烯丙基-β-環(huán)糊精（allyl-β-⑶）單體的制備，依次進(jìn)行以下步驟：
[0010] ①、準(zhǔn)確稱(chēng)取20克氫氧化鈉（NaOH)，20g β -環(huán)糊精，然后加入20mL水，50~70°C 水浴1. 5~2. 5h (較佳為60°C水浴2h)，不斷攪拌從而實(shí)現(xiàn)均勻混合；
[0011] ②、在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在步驟①所得物中加入4mmol烯丙基溴，于50~70°C繼續(xù)攪拌 1. 5~2. 5h (較佳為60°C繼續(xù)攪拌2h);
[0012] ③、將上述步驟②所得混合物50~70 °C水浴25~35min (較佳為60 °C水浴 30min)，然后將其轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱中，干燥至恒重（約60°C干燥2~3天），得固體混合 物；
[0013] ④、將步驟③所得的固體混合物研磨成粉末（過(guò)200目篩），得烯丙基-β-環(huán)糊精 (allyl-β-Ο))單體（粉末狀）；
[0014] 2)、烯丙基-β-環(huán)糊精分子印跡聚合物的制備，依次進(jìn)行以下步驟：
[0015] ①、稱(chēng)取2. 80g步驟1)所得稀丙基-β -環(huán)糊精（allyl-β -⑶）單體，加入無(wú)水乙 醇洗滌；
[0016] 備注說(shuō)明：重復(fù)洗滌5次，每次持續(xù)5分鐘；加入無(wú)水乙醇洗滌的目的是為了去除 烯丙基-β-環(huán)糊精（allyl-β-⑶）單體可能存在的試劑殘留；
[0017] 然后先加入40mL的N，N-二甲基甲酰胺攪拌25~35min (較佳為30min)，再 加入2mmol鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，于45~60 °C磁力攪拌 (600rpm) 1. 5 ~2. 5h (較佳為 2h);
[0018] ②、取上述步驟①所得到1/3體積的溶液，加入12mmol功能單體于45~60°C磁力 攪拌（600rpm)，充分反應(yīng)Ih ;
[0019] ③、在步驟②所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入40mg偶氮二異丁腈（AIBN)作為引物，然后加入 60mmol乙稀乙二醇二甲基丙稀酸（EGDMA)，45~60°C磁力攪拌（600rpm)反應(yīng)30min ;
[0020] ④、將上述步驟③所得的固體產(chǎn)物50~70°C水浴22~24h(較佳為60°C水浴 24h)，然后放入鼓風(fēng)干燥箱里，干燥至恒重（約60°C干燥2~3天）；
[0021] ⑤、將上述步驟④所得的固體，研磨后過(guò)400目篩，用50~70°C的熱水洗滌（目的 是去除反應(yīng)試劑），獲得印跡孔穴模板；
[0022] ⑥、利用甲醇：=乙酸9:l(v/v)體積比的混合液對(duì)印跡孔穴模板內(nèi)部進(jìn)行索氏抽 提（一般為于65~75°C抽提46~50h，較佳為70°C抽提48h)，直至用紫外可見(jiàn)分光光度 法檢測(cè)不到鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP)，然后用甲醇洗滌除去殘留的乙酸，可獲得烯丙 基-β -環(huán)糊精分子印跡聚合物。
[0023] 作為本發(fā)明的烯丙基-β -環(huán)糊精分子印跡聚合物的制備方法的改進(jìn)：
[0024] 所述步驟2)中：
[0025] 步驟②的功能單體為：甲基丙烯酸（MA)、甲基丙烯酸甲酯（MMA)或丙烯腈（AN);
[0026] 對(duì)應(yīng)的步驟⑤所得的印跡孔穴模板為：甲基丙烯酸-烯丙基-β -環(huán)糊精分子印 跡聚合物（M-MA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β-環(huán)糊精分子印跡聚合物（M-MM)，丙烯 腈一烯丙基-β -環(huán)糊精分子印跡聚合物（M-AN)。
[0027] 本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述烯丙基-β_環(huán)糊精分子印跡聚合物進(jìn)行的分子印 跡技術(shù)吸附鄰苯二甲酸二乙基己酯的方法，包括如下步驟：
[0028] 1)、制備樣品待測(cè)液和作為標(biāo)品的鄰苯二甲酸二乙基己酯溶液；
[0029] 2)、將烯丙基-β -環(huán)糊精分子印跡聚合物用甲醇和水依次洗滌，然后風(fēng)干至恒 重；接著分別加入至步驟1)所得的樣品待測(cè)液和鄰苯二甲酸二乙基己酯溶液中，直至烯丙 基-β -環(huán)糊精分子印跡聚合物的濃度為100~400ng/ml ;
[0030] 烯丙基-β -環(huán)糊精分子印跡聚合物例如可選用：甲基丙烯酸-烯丙基-β -環(huán) 糊精分子印跡聚合物（M-MAA)，甲基丙烯酸甲酯-烯丙基-β-環(huán)糊精分子印跡聚合物 (M-MMA)，丙烯腈一烯丙基-β-環(huán)糊精分子印跡聚合物（M-AN);
[0031] 3)、在步驟2)所得液中加入50%甲醇，所述50%甲醇與步驟2)所得液的體積比 為1~3 :1 ;
[0032] 上述50 %甲醇是指體積濃度為50 %的甲醇水溶液；
[0033] 4)、利用甲醇：乙酸=9:1(v/v)體積比的混合液對(duì)步驟3)所得物進(jìn)行洗脫；洗脫 25~35min(較佳為30min)后將所得的殘留物用氮?dú)獯蹈?，然后加入甲醇（Img氮?dú)獯蹈伤?得物配用ImL甲醇）充分溶解，220nm膜過(guò)濾后HPLC進(jìn)行分析；
[0034] 5)、HPLC 條件
[0035] Agilentl200高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司
[0036] 色譜柱：Kinetex XB-C18 (IOOmmX 4. 60mm, 1. 8 μ m)
[0037] 流動(dòng)相：甲醇：異丙醇：水=250 :100 :50的體積比；
[0038] 流速：1mT,/mi η
[0039] 進(jìn)樣量：10 μ L
[0040] 檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm
[0041] 運(yùn)行時(shí)間：6min ;
[0042] 6)、用鄰苯二甲酸二乙基己酯溶液的HPLC檢測(cè)結(jié)果和濃度（鄰苯二甲酸二乙基己 酯的濃度）之間的關(guān)系建立HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線；將樣品待測(cè)液的HPLC檢測(cè)結(jié)果代入上述HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從而獲得樣品待測(cè)液中鄰苯二甲酸二乙基己酯的濃度。
[0043] 作為本發(fā)明的分子印跡技術(shù)吸附鄰苯二甲酸二乙基己酯的方法的改進(jìn)：
[0044] 步驟2)中：烯丙基-β-環(huán)糊精分子印跡聚合物為丙烯腈一烯丙基-β-環(huán)糊精 分子印跡聚合物（M-AN)。最佳濃度為300ng/ml~400ng/ml。
[0045] 本發(fā)明采用兩步法制備分子印跡聚合物。本發(fā)明首次用HPLC結(jié)合分子印跡法去 測(cè)定DEHP的殘留量；即，本發(fā)明首先制備功能性的烯丙基- β -環(huán)糊精分子印跡聚合物，接 著再結(jié)合待檢測(cè)樣品制備成相應(yīng)的分子印跡聚合物。
[0046] 采用本發(fā)明的方法測(cè)定鄰苯二甲酸二乙基己酯殘留，具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
[0047] 首次將分子印跡技術(shù)與HPLC相結(jié)合測(cè)定DEHP的殘留。該分析方法所需的分析樣 品用量少，操作簡(jiǎn)單、方便、快速（僅需大約2. 5小時(shí)），成本低，靈敏度高。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 實(shí)施例1、烯丙基- β -環(huán)糊精分子印跡聚合物的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟：
[0049] 1)、烯丙基-β-環(huán)糊精（allyl-β-⑶）單體的制備，依次進(jìn)行以下步驟：
[0050] ①、準(zhǔn)確稱(chēng)取20克氫氧化鈉（NaOH)，20g β -環(huán)糊精，然后加入20mL水，60°C水浴 2h，不斷攪拌從而實(shí)現(xiàn)均勻混合；
[0051] ②、在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在步驟①所得物中加入4mmol烯丙基溴，于60°C繼續(xù)攪拌2h ;
[0052] ③、將上述步驟②所得混合物60°C水浴30min，然后將其轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱中，干 燥至恒重（約60°C干燥2~3天），得固體混合物；
[0053] ④、將步驟③所得的固體混合物研磨成粉末（過(guò)200目篩），得烯丙基-β-環(huán)糊精 (allyl-β-Ο))單體（粉末狀）；
[0054] 2)、烯丙基-β-環(huán)糊精分子印跡聚合物的制備，依次進(jìn)行以下步驟：
[0055] ①、稱(chēng)取2. 80g步驟1)所得稀丙基-β -環(huán)糊精（allyl-β-CD)單體，加入無(wú)水乙 醇洗滌；
[0056] 備注說(shuō)明：重復(fù)洗滌5次，每次持續(xù)5分鐘；加入無(wú)水乙醇洗滌的目的是為了去除 烯丙基-β-環(huán)糊精（allyl-β-⑶）單體可能存在的試劑殘留；
[0057] 然后先加入40mL的N，N-二甲基甲酰胺攪拌30min，再加入2mmol鄰苯二甲酸二 乙基己醋（DEHP)，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，于45~60°C磁力攪拌（600rpm)2h ;
[0058] ②、取上述步驟①所得到1/3體積的溶液，加入12mmol功能單體于45~60°C磁力 攪拌（600rpm)，充分反應(yīng)Ih ;