一種利用魚(yú)皮制備用于治療傷口愈合的活性肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用魚(yú)皮制備用于治療傷口愈合的活性肽的方法，屬于水產(chǎn)品加工與利用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白肽具有保護(hù)胃粘膜、抗?jié)?、抗氧化、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降膽固醇、增強(qiáng)骨強(qiáng)度、預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)和生長(zhǎng)、促進(jìn)皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能。近年來(lái)，膠原蛋白肽用于促進(jìn)傷口愈合得到了人們的關(guān)注。專利CN201410274645.4 “一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法”公開(kāi)了一種鱸魚(yú)皮膠原蛋白肽可以用于促進(jìn)傷口愈合。專利CN200910114805.8 “一種小分子肽在制備促進(jìn)手術(shù)后傷口愈合藥物和食品中的應(yīng)用”公開(kāi)了膠原蛋白肽可以用于促進(jìn)傷口愈合藥物和食品中的應(yīng)用。專利CN200910210712“海洋膠原肽在制備糖尿病傷口愈合藥物、食品中的用途”公開(kāi)了可以將海洋膠原蛋白肽應(yīng)用于制備促進(jìn)糖尿病傷口愈合的藥物和食品。
[0003]目前已經(jīng)公開(kāi)膠原蛋白肽的制備方法有酶解法和發(fā)酵法。專利CN201410274645.4 “一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法”公開(kāi)了一種酶法制備具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽的方法。它是以鱸魚(yú)皮為原料，經(jīng)加酸預(yù)處理，然后加蛋白酶酶解；酶解產(chǎn)物經(jīng)膜分離、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和冷凍干燥后得到了具有促進(jìn)傷口愈合活性的海洋膠原蛋白肽。專利CN201110066530 “一種利用魚(yú)皮制備膠原蛋白肽的方法”公開(kāi)了一種發(fā)酵方法制備膠原蛋白肽，它是以魚(yú)皮為原料，通過(guò)接入枯草芽孢桿菌SUbtiliS-)或地衣芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾去除菌體，再進(jìn)行滅酶、真空濃縮、噴霧干燥得到膠原蛋白肽。然而目前已經(jīng)公開(kāi)的制備膠原蛋白肽方法制備的膠原蛋白肽缺乏抗菌肽不能有效的預(yù)防傷口感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)目前公開(kāi)技術(shù)制備的用于治療傷口愈合的膠原蛋白肽多富含促進(jìn)傷口愈合肽，而缺乏抗菌肽，不能有效防止傷口感染。本發(fā)明的目的是制備一種富含抗菌肽和促進(jìn)傷口愈合肽的活性肽產(chǎn)品，以用于治療傷口愈合。
[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:一種利用魚(yú)皮制備用于治療傷口愈合的活性肽的方法，包括如下步驟:
(1)將斜面保藏的能產(chǎn)抗菌脂肽的枯草芽孢桿菌{Bacillussubti I is) HL-1接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于37 V、150r/min培養(yǎng)16h，制備成枯草芽孢桿菌iBaciIIussub tills') HL-1種子液備用；
(2)將新鮮的魚(yú)皮剪成(0.5?1.5) cmX (0.5?1.5) cm的碎片備用；
(3)將步驟(2)制備的剪碎魚(yú)皮加入到發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中加入水和營(yíng)養(yǎng)物，混勻后得到發(fā)酵培養(yǎng)基； (4)將步驟(3)獲得的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基于115°C滅菌20min;
(5)將滅菌后的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基冷卻至室溫，然后接入步驟(I)所制備的枯草芽孢桿菌〈Bacillus subti I is) HL-1 種子液；
(6)發(fā)酵過(guò)程的控制:發(fā)酵溫度為30°C?32°C，無(wú)菌空氣通入量為0.5vvm?2.5vvm，發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為150rpm?450rpm，發(fā)酵時(shí)間為35 h?45h ；
(7)成品處理:發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液升溫至90°C保溫滅酶5min;滅酶后的發(fā)酵液冷卻至室溫后，于8000r/min離心lOmin，去掉沉淀，收集上清液；通過(guò)膜分離截留上清液中分子量在3500Da以下的活性肽組分；膜分離截留液再進(jìn)行真空濃縮和噴霧干燥后，即可得到用于治療傷口愈合的活性肽成品。
[0006]所述步驟(I)中接入的枯草芽胞桿菌HL-1能產(chǎn)生抗菌脂肽，該菌已于2015年I月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.10379，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所。
[0007]所述步驟(2)中的魚(yú)皮為鱸魚(yú)魚(yú)皮、青鱗魚(yú)魚(yú)皮、鱷魚(yú)魚(yú)皮、狹鱈魚(yú)魚(yú)皮、鋳魚(yú)魚(yú)皮、馬加魚(yú)魚(yú)皮、饅魚(yú)魚(yú)皮、大黃魚(yú)魚(yú)皮、帶魚(yú)魚(yú)皮、鞋魚(yú)魚(yú)皮、羅非魚(yú)魚(yú)皮、鰹魚(yú)魚(yú)皮、小黃魚(yú)魚(yú)皮、加力魚(yú)魚(yú)皮、石斑魚(yú)魚(yú)皮和魷魚(yú)魚(yú)皮中的一種。所述步驟(3)中魚(yú)皮的加入量以添加的魚(yú)皮的質(zhì)量占水總質(zhì)量百分比計(jì)，為5%?10%。
[0008]所述步驟(3)中營(yíng)養(yǎng)物為葡萄糖、醫(yī)藥級(jí)氯化鉀、醫(yī)藥級(jí)氯化鎂和醫(yī)藥級(jí)磷酸氫二鉀所組成的混合物。所述步驟(3)中的營(yíng)養(yǎng)物的加入量以添加的營(yíng)養(yǎng)物的質(zhì)量占水總質(zhì)量百分比計(jì)，分別為:葡萄糖0.01%?5%，醫(yī)藥級(jí)氯化鉀0.01%?5%，醫(yī)藥級(jí)氯化鎂0.01%?
5%，醫(yī)藥級(jí)磷酸氫二鉀0.01%?5%。
[0009]所述步驟(5)中枯草芽孢桿菌(ifeci77w5.subtilis)YL~\種子液的接種量以接入種子液的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為0.1%?5%。
[0010]本發(fā)明跟現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明采用能產(chǎn)抗菌脂肽的枯草芽孢桿菌
進(jìn)行目的性發(fā)酵，在得到促傷口愈合肽的同時(shí)還得到了抗菌脂肽。本發(fā)明制備的用于治療傷口愈合的活性肽不但可以促進(jìn)傷口的愈合，而且還能有效防止感染。另外，本發(fā)明制備的活性肽產(chǎn)品由于富含抗菌肽，其在保藏期間不容易被微生物所污染，有利于產(chǎn)品的保藏。
[0011]一種利用魚(yú)皮制備用于治療傷口愈合的活性肽的方法。本發(fā)明得到的活性肽產(chǎn)品既可以噴劑或凝膠劑型直接給藥用于治療傷口愈合，也可以口服的形式治療傷口愈合。本發(fā)明方法制備的活性肽產(chǎn)品不但可以促進(jìn)傷口的愈合，而且還能有效防止傷口的感染，有良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0012]為了更好地理解本發(fā)明，下面就原料的選擇、發(fā)酵參數(shù)的選擇結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。
[0013]實(shí)施例1:將斜面保藏的能產(chǎn)抗菌脂肽的枯草芽孢桿菌(feci77w5.subti I is)HL-1接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于37 °C、150r/min培養(yǎng)16h，制備成枯草芽孢桿菌心subti I is) HL-1種子液備用；將新鮮的鱸魚(yú)魚(yú)皮剪成(0.5?1.5) cm X(0.5?1.5)cm的碎片備用。向發(fā)酵罐中加入5公斤剪碎的鱸魚(yú)魚(yú)皮、100公斤水、1000克葡萄糖、500g醫(yī)藥級(jí)氯化鉀、300克醫(yī)藥級(jí)氯化鎂和500克醫(yī)藥級(jí)磷酸氫二鉀，混勻并作為培養(yǎng)基；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基于115°C滅菌20min后備用；向滅菌冷卻的發(fā)酵罐中接入2公斤枯草芽孢桿菌subtilisnL-l種子液；發(fā)酵溫度為32°C，無(wú)菌空氣通入量為2.0vvm,發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為400rpm，發(fā)酵時(shí)間為35h ;發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液升溫至90°C進(jìn)行保溫滅酶5min ;滅酶后的發(fā)酵液冷卻后，于8000r/min離心lOmin，去掉沉淀，收集上清液；上清液通過(guò)膜分離截留上清液中分子量在3500Da以下的活性肽組分；將膜分離截留液再進(jìn)行真空濃縮和噴霧干燥后，