一種汗腺細(xì)胞勻漿液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜贅蛹?xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人體汗腺再生研究領(lǐng)域。具體說來，本發(fā)明涉及一種在非轉(zhuǎn)基因條件下，利用含汗腺細(xì)胞勻漿液的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚被覆于身體表面，是人體最大的器官。排汗功能是其眾多功能之一，可排出機(jī)體25%的熱量以保持體溫的相對(duì)恒定。輕度燒傷時(shí)汗腺細(xì)胞可以其深部未受創(chuàng)的部分為模板而完全修復(fù)，但全層大面積燒傷患者因汗腺被毀或被瘢痕組織堵隔而喪失了分泌汗液的功能，這不僅給患者的生理與心理帶來嚴(yán)重障礙，而且對(duì)其后期的生活與工作質(zhì)量將產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，研究皮膚損傷后汗腺組織的修復(fù)與再生，不僅是創(chuàng)(燒、戰(zhàn))傷治療本身的需要，而且也是重塑人體生理與心理的需要，值得人們關(guān)注。
[0003]近年來，隨著干細(xì)胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)研究的深入，利用成體干細(xì)胞及其可塑性為皮膚附屬器的再生帶來了新的希望。利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)再生汗腺主要包括以下優(yōu)點(diǎn):一是MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潛能；二是MSCs存在于骨髓基質(zhì)，在大面積創(chuàng)傷、燒傷時(shí)受到外界的直接破壞作用比較小；三是儲(chǔ)存量比較大，在嚴(yán)重創(chuàng)傷和燒傷條件下能夠發(fā)生動(dòng)員，容易獲取?；谝陨显?，深入開展MSCs的分化調(diào)控研究對(duì)皮膚汗腺再生策略具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0004]我們和他人大量的前期研究已經(jīng)初步證明MSCs直接參與了皮膚損傷修復(fù)與再生的全過程，其中包括:皮膚組織損傷后，造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到循環(huán)細(xì)胞池，并遷移到損傷部位。在此基礎(chǔ)上，我們實(shí)驗(yàn)室又進(jìn)一步開展了 MSCs向汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究工作，目前通過MSCs與熱休克汗腺直接共培養(yǎng)技術(shù)，已成功將MSCs誘導(dǎo)成為汗腺細(xì)胞或汗腺樣細(xì)胞。但此項(xiàng)技術(shù)的缺點(diǎn)是被誘導(dǎo)成為汗腺樣細(xì)胞的MSCs中混雜有原始的汗腺細(xì)胞，因此影響了這項(xiàng)技術(shù)在臨床治療上的推廣應(yīng)用。為解決這一技術(shù)難題，我們發(fā)明了一種汗腺細(xì)胞勻漿液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜贅蛹?xì)胞的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明提供了一種汗腺細(xì)胞勻漿液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜贅蛹?xì)胞的非轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟:
[0006]a)分離并培養(yǎng)MSCs，用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白⑶29、⑶44和CD105 ；
[0007]b)分離并培養(yǎng)汗腺細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白CEA、CK7、CK8和 CK19 ；
[0008]c)將上述培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞通過超聲波法進(jìn)行勻漿處理，之后離心去除細(xì)胞雜質(zhì)，使之形成含汗腺勻漿液的條件培養(yǎng)基；
[0009]d)使用上述含汗腺勻漿液的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化；
[0010]優(yōu)選地，含汗腺勻漿液的條件培養(yǎng)基，濃度為I X 15個(gè)細(xì)胞勻漿液/ml。
[0011]優(yōu)選地，誘導(dǎo)時(shí)MSCs的細(xì)胞密度為3X105/ml。
[0012]優(yōu)選地，MSCs向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)時(shí)間為8天。
【附圖說明】
[0013]圖1描述了免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志性蛋白⑶29、⑶44和⑶105的表達(dá)。其中(A)為空白對(duì)照；(B)為 CD29 ； (C)為⑶ 105 ； (D)為 CD44 ;bar=100um。
[0014]圖2描述了免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)汗腺細(xì)胞表面標(biāo)志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19的表達(dá)。其中(A)為 CEA ； (B)為 CK7 ； (C)為 CK8 ； (D)為 CK19 ;bar=100um。
[0015]圖3描述了 MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的改變。其中(A)為MSCs誘導(dǎo)前的形態(tài)；(B)為MSCs誘導(dǎo)后4天的形態(tài)；(C)為MSCs誘導(dǎo)后8天的形態(tài)；(D)為正常汗腺細(xì)胞的形態(tài)；bar=100umo
[0016]圖4描述了 MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)8天后細(xì)胞表型的改變。其中(A，B)為誘導(dǎo)前后CEA的表達(dá)；(C，D)為誘導(dǎo)前后CK7的表達(dá)；(E，F(xiàn))為誘導(dǎo)前后CK8的表達(dá)；(G，H)為誘導(dǎo)前后CK19 的表達(dá)；bar=10um。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下本發(fā)明以具體實(shí)施例的方式具體闡述發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，以下的實(shí)施例是為了闡述發(fā)明，而非限定發(fā)明的范圍。
[0018]實(shí)施例
[0019]實(shí)施例1MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定
[0020]無菌條件下取正常志愿者的髂骨骨髓約2ml，采用直接貼壁法，以含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(lOOyg/ml)的DMEM為培養(yǎng)液，在37°C、5% C02孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)基，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每2?3d換液I次。待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，用0.125%的胰蛋白酶消化，給予傳代培養(yǎng)和組化檢測(cè)。取細(xì)胞爬片，用預(yù)冷的甲醛丙酮混合液(體積比1:1))固定30min，按二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒說明分別進(jìn)行⑶29、⑶105和CD44的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。
[0021]免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明:上述從人骨髓分離培養(yǎng)的細(xì)胞，均表達(dá)CD29(圖1B)和⑶105 (圖1C)，高表達(dá)⑶44 (圖1D)，而空白對(duì)照組無陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。說明此細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而且純度較高。
[0022]實(shí)施例2汗腺細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
[0023]取約0.13cmX2.1Ocm的全層正常皮膚，置于含有青霉素(100U/ml)和鏈霉素(ΙΟΟμ g/ml)的人平衡鹽溶液中反復(fù)漂洗，去除皮下脂肪，在60mm2培養(yǎng)皿中將皮膚剪成Imm3左右的小塊，加入含有II型膠原酶(2mg/ml)、胎牛血清(5% )、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100yg/ml)的DMEM液3ml，置37°C、5% C02、95% 02、飽和濕度孵箱中過夜。次日在清潔的、紫外線消毒的50X倒置相差顯微鏡下挑取汗腺組織，置37°C、5% C02,95% 02、飽和濕度條件下培養(yǎng)。汗腺培養(yǎng)液以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，補(bǔ)加胎牛血清(5%)、重組人表皮生長(zhǎng)因子(10ng/ml)、三碘甲狀腺原氨酸(2ng/ml)、半琥珀酰氫化可的松(0.14 μ g/ml)、胰島素2轉(zhuǎn)鐵蛋白2亞硒酸鈉(lml/100ml)(以上試劑均購(gòu)于Gibco)及青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100 μ g/ml)。待人汗腺細(xì)胞貼壁后，補(bǔ)加約2ml汗腺培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2?3d換液一次。待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，用0.125%胰蛋白酶消化，給予爬片檢測(cè)。按前述的細(xì)胞固定及免疫細(xì)胞化學(xué)法行CEA、CK7、CK8和CK19檢測(cè)。
[0024]免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明:上述從人皮膚分離培養(yǎng)的細(xì)胞，均表達(dá)CEA (圖2A)、CK7 (圖2B)、CK8 (圖2C)和CK19 (圖2D)。說明此細(xì)胞為汗腺細(xì)胞，而且純度較高。
[0025]實(shí)施例3將上述培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞進(jìn)行勻漿獲得含汗腺細(xì)胞勻漿液的條件培養(yǎng)基
[0026]原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞達(dá)70%?80%融合后，用0.125%的胰蛋白酶消化后，制成細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并加入新的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 105/ml，然后利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將細(xì)胞勻漿，離心去除細(xì)胞雜質(zhì)，收集上清即獲得含汗腺細(xì)胞勻漿液的條件培養(yǎng)基，放_(tái)80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027]實(shí)施例4含汗腺細(xì)胞勻漿液的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化
[0028]將MSCs于誘導(dǎo)前一天以3X 105/ml的密度接種于60_2的培養(yǎng)皿中，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)。對(duì)照組使用新鮮的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組使用含汗腺細(xì)胞勻漿液的條件培養(yǎng)基，誘導(dǎo)時(shí)間為8天。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次。
[0029]1.MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的改變:MSCs誘導(dǎo)前體積較大，呈纖維狀分散性分布(圖3A);誘導(dǎo)4天后細(xì)胞體積變小，呈多邊形且比較扁平，部分細(xì)胞可相互連接成片(圖3B);誘導(dǎo)8天后細(xì)胞進(jìn)一步連接成片，如“鋪路石”樣生長(zhǎng)(圖3C)，形態(tài)類似汗腺上皮細(xì)胞(圖 3D)。
[0030]2.MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后細(xì)胞表型的改變:MSCs經(jīng)熱休克汗腺條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)8天后，按前述的細(xì)胞固定及免疫細(xì)胞化學(xué)法行CEA、CK7、CK8和CK19檢測(cè)。結(jié)果顯示:被誘導(dǎo)的細(xì)胞中有50-70%的細(xì)胞呈CEA (圖4B)、CK7 (圖4D)、CK8 (圖4F)和CK19(圖4H)染色陽(yáng)性。而對(duì)照組沒有檢測(cè)到CEA (圖4A)、CK7 (圖4C)、CK8 (圖4E)和CK19 (圖4G)染色陽(yáng)性的細(xì)胞。
[0031]以上結(jié)果說明:經(jīng)過建立適當(dāng)?shù)捏w外汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，中胚層的MSCs可以通過跨胚層轉(zhuǎn)分化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜贅蛹?xì)胞，并且從形態(tài)、表面標(biāo)志等方面確證這些轉(zhuǎn)分化來源的細(xì)胞為汗腺細(xì)胞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.分離并培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白CD29、CD44 和 CD105。
2.分離并培養(yǎng)汗腺細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19。
3.將上述培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過超聲波法進(jìn)行勻漿處理，之后離心去除細(xì)胞雜質(zhì)，使之形成含汗腺勻漿液的條件培養(yǎng)基，濃度為IX 15個(gè)細(xì)胞勻漿液/ml。
4.使用上述含汗腺勻漿液的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，誘導(dǎo)時(shí)MSCs的細(xì)胞密度為3X 105/ml，誘導(dǎo)8天后獲得汗腺樣細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人體汗腺再生研究領(lǐng)域。具體說來，本發(fā)明涉及一種在體外培養(yǎng)條件下，通過含汗腺勻漿液的條件培養(yǎng)基，誘導(dǎo)成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞的方法。
【IPC分類】C12N5-0775, C12N5-071
【公開號(hào)】CN104651303
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310585168
【發(fā)明人】張翠萍, 付小兵
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2013年11月16日