豬流行性腹瀉病毒分離技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及畜用生物制品領(lǐng)域，特別涉及豬流行性腹瀉病毒分離技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的一種急性腸道傳染病，以水瀉、 嘔吐和脫水為特征。俗稱冬季拉稀病。其病原屬于冠狀病毒科冠狀毒病屬。
[0003] 豬流行性腹瀉病毒可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡的豬都易感。哺乳仔豬、架子豬 和育肥豬的發(fā)病率可達100 %，尤其以哺乳仔豬嚴重。本病主要在冬季多發(fā)，夏季也可發(fā)生。 中國從12月份至次年2月份為本病的高發(fā)期。常常是有一頭豬發(fā)病后，同圈或鄰圈的豬在 1周內(nèi)相繼發(fā)病，病毒多經(jīng)發(fā)病豬的糞便排出，運輸車輛、飼養(yǎng)員的鞋子或其他帶病毒的動 物，都可作為傳播媒介，造成較高的死亡率和損失。而現(xiàn)有的方法得到的病毒滴度低，限制 高滴度的豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗的研制。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)常使用生長良好的Vero細胞，依次進行連續(xù)傳三代，將第三代的細胞收 獲凍存，留3瓶T-25方瓶細胞進行后面的實驗。將續(xù)傳后的3瓶T-25方瓶細胞用20 μ g/ ml胰蛋白酶的無血清DMEM洗3遍，IOmin/遍。將含20 μ g/ml胰蛋白酶的PEDV濾液2ml， 37°C條件下靜置I. 5h以后注入3瓶T-25方瓶細胞中，每瓶2ml，37°C條件下靜置I. Oh。棄 掉T-25方瓶中液體，然后加入20 μ g/ml胰蛋白酶的DMEM維持液，37°C靜置培養(yǎng)96h，收集 豬流行性腹瀉病毒液，并對病毒進行稀釋。細胞病變效應（CPE)和半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量 (TCID 5tl)數(shù)據(jù)記錄結(jié)果如表1所示。
[0005] 表I CPE和TCID5tl數(shù)據(jù)記錄結(jié)果
[0006]
[0007]
【主權(quán)項】
1. 豬流行性腹瀉病毒分離技術(shù)，其特征在于，包括以下步驟： 用支原體去除劑將Vero細胞的支原體去除，進行細胞培養(yǎng)；對培養(yǎng)后的細胞注入胰蛋 白酶的豬流行性腹瀉病毒濾液，靜置培養(yǎng)，收集豬流行性腹瀉病毒液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)包括： 將所述去除支原體的Vero細胞連續(xù)傳2-4代，使用牛胰蛋白酶的無血清DMEM維持液 將經(jīng)過續(xù)傳2-4代的所述Vero細胞洗2-4遍。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述去除支原體的Vero細胞連續(xù)傳 3代。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離技術(shù)，其特征在于，將經(jīng)過續(xù)傳2-4代的所述Vero細胞 洗3遍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述牛胰蛋白酶的無血清DMEM維持 液為 50 μ g/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述對培養(yǎng)后的細胞注入胰蛋白酶 的豬流行性腹瀉病毒濾液的步驟包括： 將牛胰蛋白酶的豬流行性腹瀉病毒濾液注入洗過的所述第2-4代細胞，37°C條件下靜 置，棄掉液體，加入牛胰蛋白酶的DMEM維持液，37°C靜置培養(yǎng)，收集豬流行性腹瀉病毒液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述牛胰蛋白酶的豬流行性腹瀉病 毒濾液使用前在37°C條件下，靜置I. 5h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒分離技術(shù)還 包括以下步驟：將所述豬流行性腹瀉病毒液在-20°C條件下凍融1-3次；凍融后將所述豬流 行性腹瀉病毒進行盲傳處理。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述凍融次數(shù)為一次。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離技術(shù)，其特征在于，所述Vero細胞為非洲綠猴腎細胞。
【專利摘要】本發(fā)明提供豬流行性腹瀉病毒分離技術(shù)。本發(fā)明包括以下步驟：用支原體去除劑將Vero細胞的支原體去除，進行細胞培養(yǎng)；對培養(yǎng)后的細胞注入胰蛋白酶的豬流行性腹瀉病毒濾液，靜置培養(yǎng)，收集豬流行性腹瀉病毒液。本發(fā)明豬流行性腹瀉病毒濾液與去除支原體以后的Vero細胞相互作用，在胰蛋白酶的作用下，產(chǎn)生明顯細胞病變效應的時間穩(wěn)定，沒有支原體對細胞的干擾，從而使得收獲豬流行性腹瀉病毒時，病毒滴度高。由以前的103.64半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量升高到105.38TCID50，提高了近2個滴度；細胞產(chǎn)生病變的時間推后，由以前的24-48h推遲到72h。CCTCC NO:V20142920141023
【IPC分類】C12R1-93, C12N7-00
【公開號】CN104560889
【申請?zhí)枴緾N201410673855
【發(fā)明人】李明義, 張玉杰, 劉陽, 李曉林, 張倫, 馮晶晶, 李佳棋, 單學強, 王相芹, 朱浩, 葛棟, 羅濟冠, 李世鑫, 李朝陽
【申請人】山東信得科技股份有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月21日