一種檢測抗豬流行性腹瀉病毒抗體的elisa檢測試劑盒及其使用方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測抗豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA檢測試劑盒及其使用方 法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征 的急性高度接觸性腸道傳染病，哺乳仔豬感染后具有高致死率和高感染率。各個年齡 段的豬均易感染，該病最初于1971年在比利時和英國發(fā)現(xiàn)，此后，許多國家陸續(xù)報道該 病的流行，在仔豬尤為嚴(yán)重，1976年我國首次報道該病；1955年，國際病毒分類委員會 (International Committeeon Taxonomy of Viruses, ICTV)在第6 次報告中將豬流行性腹 瀉病毒歸為冠狀病毒屬。盡管我國部分豬場采取了 PEDV的疫苗免疫措施，但我國自2010年 以來，全國大部分養(yǎng)豬地區(qū)再度暴發(fā)該病，造成極其嚴(yán)重的損失。近年，韓國也發(fā)生該病流 行，至2013年以來該病又在美國、日本等國家也相繼發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？傮w上， 該病已遍布世界養(yǎng)豬地區(qū)，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 目前，對PEDV的診斷方法主要有臨床診斷、免疫膠體金、ELISA、RT-PCR等診斷方 法。他們的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性都很好逐漸被人們所重視。ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，它是目 前應(yīng)用比較多，發(fā)展比較快的一種抗體檢測方法。此方法即可檢測抗原，能夠直接檢測出 糞便中的抗原，也可以檢測抗體，當(dāng)豬場當(dāng)中出現(xiàn)腹瀉的癥狀時即可用于檢測，可做到早診 斷，早治療，被廣泛的應(yīng)用于臨床檢測。
[0004] 現(xiàn)有文獻(xiàn)中制備的檢測試劑盒，準(zhǔn)確度不高，市售的試劑盒的準(zhǔn)確度較高，如，R&B 公司的Porcine-PEDV試劑盒，但是售價高，使用成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種檢測PEDV。
[0006] 本發(fā)明檢測抗豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，它是以氨基酸序列如 SEQ ID NO :2所示的重組豬流行性腹瀉病毒N蛋白為抗原，檢測待檢樣品中是否含有抗豬 流行性腹瀉病毒的抗體。
[0007] 所述ELISA檢測試劑盒為間接ELISA檢測試劑盒，它包括如下組分：
[0008] (1)氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重組豬流行性腹瀉病毒N蛋白；
[0009] (2)酶標(biāo)板；
[0010] ⑶抗原包被液；
[0011] ⑷洗滌液；
[0012] ⑶封閉液；
[0013] (6)樣品稀釋液；
[0014] ⑵酶標(biāo)二抗；
[0015] (8)底物液；
[0016] ⑶終止液。
[0017] 其中，所述抗原包被液是為碳酸鹽溶液。
[0018] 其中，所述洗滌液是PBST溶液。
[0019] PBST 溶液：ρΗ7· 4,0· 2g KH2P04,0. 2g KC1，2. 9g Na2HP04. 12H20,8. Og NaCl， 0· 5mL Tween-20,加入去離子水定容至1000mL。
[0020] 其中，所述封閉液為5 %的脫脂牛奶、I %的BSA或3 %的明膠。
[0021] 其中，所述樣品稀釋液為PBST溶液。
[0022] 其中，所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG。
[0023] 其中，所述底物液是濃度為0. 208mmol/L的TMB溶液。
[0024] 其中，所述終止液是濃度為2mol/L的H2SO4溶液。
[0025] 本發(fā)明還提供了前述檢測試劑盒的使用方法，它包括如下步驟：
[0026] (1)包被：取氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重組豬流行性腹瀉病毒N蛋白，用 包被液稀釋至蛋白濃度為〇. 313~10 μ g/mL，包被酶標(biāo)板，洗滌；
[0027] (2)封閉：加入封閉液封閉，洗滌；
[0028] (3)加待檢樣品：取待檢樣品，用稀釋液稀釋10~320倍，加入微孔板中，37°C溫 育Ih，洗滌；
[0029] (4)加酶標(biāo)二抗：取酶標(biāo)二抗，用稀釋液稀釋2000倍，加入微孔板中，37°C反應(yīng) 30min，洗絳；
[0030] (5)加底物：加入底物液，室溫避光反應(yīng)10~15min ;
[0031] (6)終止反應(yīng)：加入終止液，終止反應(yīng)，測定其0D450值。
[0032] 步驟（1)中，所述用包被液稀釋至蛋白濃度為2. 5 μ g/mL。
[0033] 步驟（2)中，待檢樣品，用稀釋液稀釋20倍。
[0034] 本發(fā)明還提供了前述檢測試劑盒在制備豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒中的用 途。
[0035] 本發(fā)明包含重組N蛋白的ELISA檢測試劑盒可以準(zhǔn)確檢測豬流行性腹瀉病毒，與 市售的R&B公司的Porcine-PEDV試劑盒的檢測結(jié)果基本一致，可以用于替代市售的試劑盒 使用，同時本發(fā)明試劑盒的特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡單、快速，制備方法簡單，成本低廉。
[0036] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0037] 圖I PEDV N基因的RT-PCR擴(kuò)增。M :DL2000 ;1 :陰性對照；2-3 :RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 N基因；；
[0038] 圖2重組質(zhì)粒P GEM-T-N的雙酶切鑒定。M :DNA Marker III ;1_2 :質(zhì)粒PCR ;3 :陰 性對照；4-5 :BamH I和XhoI雙酶切產(chǎn)物；
[0039] 圖3 PEDV N基因核苷酸序列同源性比較；
[0040] 圖4 PEDV N基因氨基酸序列同源性比較；
[0041] 圖5 PEDV N基因進(jìn)化樹；圖6重組質(zhì)粒的質(zhì)粒PCR。M :DNA Marker III ; 1-3 :質(zhì)粒 PCR ;4 :對照；
[0042] 圖 7 重組質(zhì)粒 pET-28a-N 的雙酶切鑒定。M :DNA Marker III ;1_2 :BamH I 和 XhoI 雙酶切產(chǎn)物；
[0043] 圖8重組蛋白不同誘導(dǎo)表達(dá)時間。M :蛋白Marker ;1 :pET-28a_N誘導(dǎo)前對照；2 : 誘導(dǎo)后Ih ;3 :誘導(dǎo)后2h ;4 :誘導(dǎo)后3h ;5 :誘導(dǎo)后4h ;6 :誘導(dǎo)后5h ;7 :誘導(dǎo)后6h ;8 :誘導(dǎo)后 7h ;9 :pET-28a誘導(dǎo)后對照；
[0044] 圖9重組蛋白不同誘導(dǎo)表達(dá)溫度。M :蛋白Marker ;1 :25°C誘導(dǎo)；2 :30°C誘導(dǎo)3 : 37°C誘導(dǎo)；
[0045] 圖10重組蛋白不同誘導(dǎo)IPTG濃度。M :蛋白Marker ;1 :pET-28a誘導(dǎo)后對照；2 : pET_28a_N 誘導(dǎo)前；3 :0· 2mM ;4 :0· 4mM ；5 ：0. 6mM ；6 ：0. 8 ；7 ：1. OmM ；8 ：1. 2mM ；
[0046] 圖11重組蛋白可溶性分析。M :蛋白Marker ;1 :pET_28a誘導(dǎo)后對照2 :總菌液； 3 :破菌后上清；4 :包涵體溶解液；
[0047] 圖12重組蛋白的純化結(jié)果。M:蛋白Marker ;1_2 :純化后蛋白；
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