專利名稱:人類成體干細胞分化成胰島素分泌細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人類成體干細胞分化成胰島素分泌細胞。
背景技術(shù)：
I型糖尿病，也被稱為胰島素依賴性糖尿病，特征在于胰島素產(chǎn)生β細胞的損失，通常由在胰腺中胰島的自體免疫攻擊產(chǎn)生，導(dǎo)致胰島素的缺乏。胰島素在體內(nèi)血糖水平的動態(tài)平衡上扮演關(guān)鍵角色。當胰島素缺乏或以低量產(chǎn)生時，血糖水平增加，導(dǎo)致各種器官例如腎、神經(jīng)、視網(wǎng)膜等中的并發(fā)癥。I型糖尿病的治療大多數(shù)依賴于胰島素的使用，需要在患者的一生中注射。胰島素的使用不是對I型糖尿病的根本治療。另一方面，使用外來胰腺或β細胞的移植治療I型糖尿病。然而，該方法受許多由于來自外來胰腺的外科手術(shù)移植導(dǎo)致的組織學上的限制。例如，移植的細胞可能被接收者的自體免疫反應(yīng) 干擾。近年來，許多研究已經(jīng)聚焦于使用干細胞開發(fā)用于糖尿病的治療，其中胚胎和成體干細胞是有代表性的。研究已經(jīng)報道胚胎干細胞能夠離體(ex vivo)分化成胰島素產(chǎn)生細胞，其被發(fā)現(xiàn)當移植到糖尿病小鼠時治療高血糖[Fujikawa T，Oh SH, Pi L，HatchHM,Shupe T, Petersen BE(2005)Teratoma formation leads tofailure of treatment fortype I diabetes using embryonic stemcell-derived insulin-producing cells. AmJ Pathol 166，1781-1791 ;D’ Amour KA, Bang AG，Eliazer S，Kelly 0G, AgulnickAD，Smart NG, Moorman MA, Kroon E，Carpenter MK, Baetge EE (2006)Production ofpancreatic hormone-expressing endocrine cellsfrom human embryonic stem cells.Nat Biotechnol 24，1392-1401]。然而，胚胎干細胞具有當移植時引起癌癥產(chǎn)生的極大臨床問題[Kroon E，Martinson LA，Kadoya K，Bang AG，Kelly 0G, Eliazer S，Young H，Richardson M，Smart NG，Cunningham J，Agulnick AD，D’ Amour KA，Carpenter MK，BaetgeEE(2008)Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cellsgeneratesglucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26，397-398]。
已有報道外胚層袓細胞能夠分化成胰島素產(chǎn)生細胞[HOTi Y，GuX, Xie X，andKim SK. (2005)Differentiation ofinsuI in-producing cells from human neuralprogenitor cells. PLoS Med. 2，103]并且胰管上皮細胞能夠分化成與胰腺中胰島的那些相同的結(jié)構(gòu)[Bonner-Weir S，Taneja MiWeir GC, Tatarkiewicz K，Song KH, Sharma A andO’Neil JJ(2000)Invitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.Proc Natl Acad Sci USA. 97，7999-8004]。前者在的不利之處在于胰島素產(chǎn)生細胞獲自胎兒腦細胞，其可能在接受者中誘導(dǎo)腫瘤[Amariglio NiHirshberg A，Scheithauer BW, CohenY， LoewenthalR, Trakhtenbrot L， Paz N， Koren-Michowitz M， Waldman D， Leider-TrejoL，Toren A，Constantini S，Rechavi G. Donor-derived brain tumor following neuralstem ce11transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 2009 Feb17；6(2) :el000029]。后者的不利之處在于僅非常受限量的干細胞能夠從胰管組織中獲得。此外，報道當胚胎干細胞在包含胰島素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化時，從分化細胞分泌的胰島素實際上為取自培養(yǎng)基的胰島素，這被分裂成胰島素和C-肽的前肽沒有分泌的事實證明[Rajagopal J,Anderson WJ,Kume S,Martinez 01,andMelton DA(2003)Insulin stainingof ES cell progeny frominsulin uptake. Science. 299,363 ；Hansson M, Tonning A,Frandsen U, Petri A, Rajagopal J, Englund MC, Heller RS, Hakansson J, Fleckner J,Skold HN, melton K, Semb H, and SerupP(2004)Artifactual insulin release fromdifferentiatedembryonic stem cells. Diabetes 53,2603-2609]。因此，近年來已經(jīng)進行許多嘗試以在不存在胰島素下誘導(dǎo)分化胚胎干細胞。如以下表I中總結(jié)的，在胰島素樣生長因子(insulin-line growthfactors)或β細胞素(betacellulin)的存在下干細胞分化成胰島素產(chǎn)生細胞方面已有報道。如上所述，種族問題和癌癥產(chǎn)生，使得難以利用胚胎干細胞治療糖尿病。此外，僅顯著低水平的胰島素和C-肽由于來自基于人類皮膚成纖維細胞或間充質(zhì)干細胞的多潛能干細胞的分化而產(chǎn)生。表I
對干細胞離體分化成胰島素產(chǎn)生細胞的研究
IiS分泌的胰島素~分泌的C-肽參考文獻
胚胎干細胞-5ng/ug DNAJiang et al. ,20071)
皮膚成纖維細胞O. 15ng/ug DNA Tateishi et al. ,20082)
~間充質(zhì)干細胞1.291mU/L163ng/LLi et al. ,20083)
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2)Tateishi K, He J, Taranova 0, Liang G, D，Alessio AC, Zhang Y(2008)Generation of insulin-secreting islet-1ikeclusters from human skinfibroblasts. J Biol Chem. 283，31601-31607.
3)Li L, Li F, Qi H, Feng G,Yuan K, Deng H, Zhou H. (2008) Coexpression of Pdxland betacellulin in mesenchymal StemCells could promote the differentiation ofnestin-positiveepithelium-like progenitors and pancreatic islet-likespheroids.Stem Cells Dev. 17,815-823。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中完結(jié)的精深全面的研究由本發(fā)明人進行，涉及用于I型糖尿病的細胞治療。該研究導(dǎo)致以下發(fā)現(xiàn)當在各種已知在培養(yǎng)基中對分化成β細胞有效的細胞因子和生長因子的存在下進行時，并且其中培養(yǎng)基的葡萄糖濃度從高水平改變?yōu)榈退綍r，人類成體干細胞的孵育允許成體干細胞分化成高度有效的胰島素產(chǎn)生細胞。
因此，本發(fā)明的目的在于提供用于使成體干細胞分化成胰島素分泌細胞的方法。


根據(jù)以下詳細描述連同附圖，將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點，其中
圖I為源自眼睛周圍的皮下層的干細胞在各種條件下被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞三周后，顯示細胞形態(tài)的光學顯微照片；
圖2為源自眼睛周圍的皮下層的干細胞在各種條件下被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小時后，顯示通過酶聯(lián)免疫吸附檢測測定的分泌的胰島素的量的條形圖；
圖3為源自眼睛周圍的皮下層的干細胞在各種條件下被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小時后，顯示通過酶聯(lián)免疫吸附檢測測定的分泌的C-肽的量的條形圖；
圖4為源自眼睛周圍的皮下層的干細胞在各種條件下被誘導(dǎo)分化 成胰島素分泌細胞三周后，顯示通過免疫細胞化學檢測測定的胰島素、胰島素原、CK19和C-肽的表達的光學顯微照片；
圖5是源自眼睛周圍的皮下層的干細胞被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞三周后，顯示從所述獲得的細胞分離的β細胞的特性基因的表達的瓊脂糖凝膠照片；
圖6為源自眼睛周圍的皮下層的干細胞被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞三周后，顯示獲得的細胞的對胰島素產(chǎn)生β細胞特異的二硫腙(dithizone)染色的顯微照片；
圖7為源自眼睛周圍的皮下層的干細胞在各種條件下被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小時后，顯示通過酶聯(lián)免疫吸附檢測測定的分泌的胰島素的量的條形圖；以及
圖8為源自眼睛周圍的皮下層的干細胞在各種條件下被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小時后，顯示通過酶聯(lián)免疫吸附檢測測定的分泌的C-肽的量的條形圖。
具體實施方式
本發(fā)明主要通過兩個試驗實現(xiàn)一個檢查胰島素樣生長因子對分化的影響，另一個在β細胞素(代替激活素Α)的存在下進行分化。
根據(jù)其一方面，本發(fā)明提供離體下成體干細胞分化成胰島素分泌細胞的方法，包括在包含20-30mM葡萄糖、補充有5-20 %胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體干細胞4_10天，然后在包含4-7mM葡萄糖、補充有5-20%胎牛血清、5-20mM煙酰胺、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-100ng/ml胰島素樣生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-20天。
具體地，在存在細胞因子和生長因子包括成纖維細胞生長因子_2、煙酰胺、胰高血糖素樣肽-I、激活素A、胰島素樣生長因子等的培養(yǎng)基中，將從眼睛周圍的皮下脂肪組織分離的人類成體干細胞誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞，以用于治療I型糖尿病，所述培養(yǎng)基具有從第一培養(yǎng)基的高濃度至第二培養(yǎng)基的低濃度的葡萄糖的轉(zhuǎn)變。
把該兩步培養(yǎng)法應(yīng)用到三組。如之前由本發(fā)明人于2007年5月提交的韓國專利申請No. 2007-44663所公開的，對照用包含20_30mM葡萄糖、存在煙酰胺，激活素A和胰高血糖素樣肽-I (NAG)的培養(yǎng)基處理4-10天，隨后在包含4-7mM葡萄糖、存在相同的細胞因子的培養(yǎng)基中孵育10-20天[NAG組]。對于第二組，在包含4-7mM葡萄糖以及胎牛血清、煙酰胺、激活素A、胰高血糖素樣肽-I和胰島素樣生長因子-I的培養(yǎng)基中進行10-20天的第二孵育之前，其初步處理在包含20-30mM葡萄糖以及胎牛血清、激活素A、成纖維細胞生長因子-2和胰高血糖素樣肽-I的培養(yǎng)基中進行4-10天[NAGI1組]。關(guān)于第三組，其分化以與第二組相同的方式誘導(dǎo)，除了在第二步使用胰島素樣生長因子-2代替胰島素樣生長因子-I之外。
根據(jù)其另一方面，本發(fā)明提供成體干細胞離體分化成胰島素分泌細胞的方法，其特征在于使用β細胞素(已知對分化有效)和Β27添加劑(Β27 supplement)(已知用作血清添加劑(serum supplement))以建立用于高效地分化和胰島素分泌的條件(實施例7)。
為了使成體干細胞分化，具體地，在包含20_30mM葡萄糖(高葡萄糖培養(yǎng)基)、補充有B27添加劑，成纖維細胞生長因子-2和表皮生長因子的培養(yǎng)基中進行孵育1-7天，然后在具有相同濃度的葡萄糖、補充有胎牛血清，激活素A，成纖維細胞生長因子-2和胰高血糖 素樣肽-I的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-7天。
其后，在包含4_7mM葡萄糖(低葡萄糖培養(yǎng)基)、存在細胞因子和生長因子包括胎牛血清、激活素A、成纖維細胞生長因子-2，胰高血糖素樣肽-I的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞1-7天，最后在包含4-7mM葡萄糖補充有胎牛血清、β細胞素、煙酰胺和胰高血糖素樣肽-I的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-20天。
在本發(fā)明中可用的為DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)或DMEM/F12 (I I的 Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基營養(yǎng)混合物(Nutrient mixture)F-12)。
以下將給出誘導(dǎo)成體干細胞分化成胰島素分泌細胞的詳細描述。
從眼睛或頰周圍的皮下層外科手術(shù)地獲得的脂肪用I型膠原酶在37°C下處理30min，然后離心。這樣獲得的細胞團在補充有胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以提供成體干細胞。
為了分化成胰島素分泌細胞，將干細胞在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-30天。首先，將它們在膠原包被的培養(yǎng)皿中在補充有5-20%胎牛血清、5-20nM胰高血糖素樣肽-I、I-IOnM激活素A和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的高葡萄糖培養(yǎng)基中孵育4_10天。其后，將它們轉(zhuǎn)移到補充有5-20%胎牛血清、5-20mM煙酰胺、5-20nM胰高血糖素樣肽-I、I-IOnM激活素A和10-100ng/ml胰島素樣生長因子的低葡萄糖培養(yǎng)基中，然后孵育10-20天。
孵育完成15-30天時，在暴露到高葡萄糖培養(yǎng)基(進行2小時)之前，將細胞在低葡萄糖培養(yǎng)基中用牛血清白蛋白(BSA)處理10-15小時。這樣最后獲得的培養(yǎng)物使用酶聯(lián)免疫吸附檢測定量分析胰島素和C-肽。發(fā)現(xiàn)與非分化條件(陰性對照)相比，本發(fā)明中定義的分化條件以提高的量誘導(dǎo)胰島素和C-肽的分泌。盡管在NAGIl組(補充有胰島素樣肽-I)和NAG組之間在胰島素和C-肽的分泌上沒有差異，使用胰島素樣肽-2(NAGI2組)允許胰島素的分泌比使用胰島素樣肽-KNAGIl組)高8倍，C-肽高6倍。在胰島素樣肽-2存在下分化的細胞的遺傳分析指出，當它們的分化在第一步的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時，ND (神經(jīng)分化因子Uneuro Dl))、PC (激素原轉(zhuǎn)化酶)l/3、PC2、NGN3、Glut (葡萄糖轉(zhuǎn)運體)l、Glut 2、pax4,pdxl—已知作為對胰腺的β細胞特異的基因-開始表達；以及在第二步的培養(yǎng)基中的孵育期間nkx 6-1和胰島素基因表達。同樣，所述細胞通過免疫化學染色測定觀察到表達CK19、胰島素原、胰島素和C-肽，并且被二硫腙，一種對胰腺的β細胞特異的染料，強烈地染色。
因此，根據(jù)本發(fā)明使成體干細胞分化成胰島素分泌細胞的方法基本上由兩步培養(yǎng)法組成，其中首先在存在成纖維細胞生長因子_2、激活素A和胰高血糖素樣肽-I的高葡萄糖培養(yǎng)基中，然后在存在煙酰胺、激活素A、胰高血糖素樣肽-I和胰島素樣生長因子-2的低葡萄糖培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)成體干細胞經(jīng)受分化，在胰島素分泌的效率上其優(yōu)于NAG組使用的方法，所述NAG組使用的方法在2007年5月提交的韓國專利申請No. 2007-44663中公開。
作為選擇，根據(jù)本發(fā)明有效的胰島素分泌細胞能夠如下從成體干細胞分化。
在包含20-30mM葡萄糖、O. 5X-4X B27添加劑、10_30ng/ml成纖維細胞生長因子_2和10-30ng/ml表皮生長因子的高葡萄糖培養(yǎng)基中將成體干細胞培養(yǎng)1_7天，然后在包含20-30mM葡萄糖、5-20 %胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10_30ng/ ml成纖維細胞生長因子-2的高葡萄糖培養(yǎng)基中1-7天，然后在包含4-7mM葡萄糖、5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5-15nM胰高血糖素樣肽-I和10_30ng/ml成纖維細胞生長因子-2的低葡萄糖培養(yǎng)基中1-7天，最后在包含5-20%胎牛血清、5-20mM煙酰胺、l-10ng/mlβ細胞素、和5-20ηΜ胰高血糖素樣肽-I的低葡萄糖培養(yǎng)基中10-20天。
在β細胞素的存在下分化后，發(fā)現(xiàn)分化的細胞(BTC)比NAG組各自高6倍地產(chǎn)生膜島素和C-妝。
因此，在存在Β27添加劑和β細胞素(分別代替胎牛血清和激活素Α)的情況下分化的細胞，能夠比NAG組更有效地分泌胰島素。
通過以下實施例可以獲得本發(fā)明的更好理解，所述實施例用于舉例說明，但不解釋為本發(fā)明的限制。實施例I干細胞的分離
在整形外科醫(yī)院在患者的允許下外科手術(shù)地從眼睛周圍的皮下層切離的脂肪組織，用O. 075% I型膠原酶溶液在37°C下處理30min，然后用與膠原酶溶液相同體積的補充有胎牛血清的培養(yǎng)基終止酶活性。離心后，這樣形成的細胞團用培養(yǎng)基洗滌兩次，并在補充有10%胎牛血清的DMEM-LG中孵育。實施例2干細胞培養(yǎng)
在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中將獲得的干細胞培養(yǎng)21天。為此，首先，將細胞以5xl03細胞/孔的密度接種在膠原包被的48孔板，在孵育(進行7天)之前，向所述膠原包被的48孔板添加包含25mM葡萄糖、補充有10%胎牛血清、4nM激活素A、10nM胰高血糖素樣肽-I和20ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養(yǎng)基(DMEM-HG)。其后，將細胞在包含5. 5mM葡萄糖，補充有10 %胎牛血清、IOmM煙酰胺、4nM激活素A、IOnM胰高血糖素樣肽_1和50ng/ml胰島素樣生長因子-I或胰島素樣生長因子-2的培養(yǎng)基(DMEM-LG)中進一步培養(yǎng)另外14天。
孵育期間，每隔3-4天將培養(yǎng)基用新培養(yǎng)基更換?？偣卜跤?周之后，如下檢查細胞的分化。實施例3分化后細胞的形態(tài)學變化
將干細胞從眼睛周圍的皮下脂肪分離并培養(yǎng)，監(jiān)視其形態(tài)學變化。盡管在無生長因子和細胞因子的培養(yǎng)基中孵育后在形態(tài)學上保持不變，但當它們用生長因子和/或細胞因子例如煙酰胺，激活素A和胰高血糖素樣肽-I或胰島素樣生長因子-I或-2處理時，觀察到所述干細胞經(jīng)受形態(tài)學變化為圓形(圖I)。誘導(dǎo)分化3周時，細胞在形態(tài)學上變圓，形成細胞簇。實施例4胰島素和C-肽分泌的檢查
3周的培養(yǎng)結(jié)束后，將細胞用補充有O. 5%牛血清白蛋白的低葡萄糖培養(yǎng)基(DMEM-LG)處理12小時。然后，將細胞暴露于DMEM-HG 2小時并使用酶聯(lián)免疫吸附檢測定量分析分泌的胰島素(圖2)。同樣，隨胰島素從胰島素原剪接的C-肽的量也使用酶聯(lián)免疫吸附檢測測定(圖3)。為了胰島素和C-肽兩者的酶聯(lián)免疫吸附檢測，使用商業(yè)上購自Mercodia, Sweden的試劑盒。將濃度為已知的標準溶液和如上獲得的培養(yǎng)物以25 μ L每孔的量平板接種在用人胰島素或C-肽包被的96孔微孔板上，其后將針對胰島素或C-肽的抗體添加到板上并孵育I小時。隨后，與TMB底物溶液孵育30分鐘，緊接著進行吸光度測定。胰島素或C-肽都不從未誘導(dǎo)分化的細胞中分泌，而發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明兩步法培養(yǎng)的組產(chǎn)生胰島素和C-肽兩者。具體地，測定在胰島素樣肽-2存在下培養(yǎng)的組(NAGI2組)比NAG組胰島素分泌約高8倍，C-肽約高6倍。實施例5對胰島素分泌細胞特異的蛋白質(zhì)的表達
在胰島素樣肽-2的存在下將從眼睛周圍的皮下脂肪獲得的干細胞誘導(dǎo)分化，其已通過酶聯(lián)免疫吸附檢測測定被證明最有效，之后使用免疫細胞化學檢測就CK19、胰島素、C-肽和胰島素原(細胞外分泌前保持未分裂)的表達，檢測所得的胰島素分泌細胞(圖4)。分化持續(xù)3周后，將細胞暴露到高濃度的葡萄糖2小時，在4°C下用4%多聚甲醛固定90分鐘，用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌3次。將細胞用3%過氧化氫處理10分鐘以除去內(nèi)源性過氧化物酶，然后與補充有2 %牛血清白蛋白的PBS在室溫下一起孵育60min以阻斷背景信號。細胞培養(yǎng)物與在PBS中的針對人CK19 (I 400)、C-肽(I 500)、胰島素(I 500)·和胰島素原(I 500)的一抗的稀釋液在4°C下反應(yīng)12小時。對于陰性對照，使用無一抗的PBS0將它們各自用生物素綴合的二抗和過氧化氫綴合的抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)處理20min，然后用3，3’_ 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)著色。與其中未誘導(dǎo)分化的對照相比，用全部煙酰胺、激活素A和胰高血糖素樣肽處理的組觀察到CK19、C-肽、胰島素和胰島素原全部具有顯著增加的表達水平(圖4)。實施例6參與胰島素分泌的基因的表達
使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，就胰島素分泌細胞的特性基因的表達，檢查在源自眼睛周圍的皮下層的干細胞誘導(dǎo)分化后第7，14和21天取得的細胞。
最初，總RNA從分化細胞分離。將ImL Tri-reagent加入試管中的細胞，并與200 μ L氯仿徹底地混合,然后在室溫下孵育15min。在14，OOOrpm下離心15min后,將這樣形成的上清液轉(zhuǎn)移到新試管并與異丙醇混合。在14，OOOrpm下離心IOmin形成團，然后向其添加75%乙醇。該懸浮液再次在14，OOOrpm下離心lOmin。抽除(drawn off)上清液，將殘余的75%乙醇蒸發(fā)，其后將殘留物溶解于無菌的去離子水，在65°C下孵育5min以洗脫RNA。該RNA通過在UV分光光度計中在260nm下讀取吸光度來定量分析。將7. 5 μ g的總RNA與Ix反應(yīng)緩沖液，ImM dNTP, O. 5mg/ml寡脫氧胸腺核苷酸(oligo-dT)，20U RNA酶抑制劑和20U M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶混合，并且在42°C下孵育(進行60min)之前添加無菌的去離子水以形成50 μ L的終體積。
在包含Ix Taq緩沖液、2mM MgCl2、0. 25U Taq聚合酶和IOpmol引物的混合溶液中進行PCR，其中所述引物序列的各cDNA與如表2中所示的各基因互補。
通過在94°C下預(yù)變性5min來開始PCR，進行35個如下循環(huán)在94°C下變性30sec，在各自溫度下退火30sec，在72°C下延伸30sec，然后在72°C下后延伸5min。將這樣獲得的15yL各PCR產(chǎn)物隨6x上樣緩沖液(loading buffer) (0. 25%溴酚藍，(λ 25% 二甲苯藍，40%庶糖)一起加載到2%瓊脂糖凝I父,在100V電場的存在下運彳丁 30min。電泳完成后，將凝膠用溴化乙錠染色，并在UV透照儀(Vilber loumat, FRANCE)上觀察。確定各基因的表達水平，并與作為對照的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)比較。為了比較分析，數(shù)據(jù)從三次測定中獲得。
在RT-PCR中用于擴增胰島素分泌細胞的各特征基因的引物序列，其名稱以及PCR產(chǎn)物的大小列于以下表2。表2


退火


大小
基因引物溫度注釋





(bp)





(dC)

5’ -acaactttggtatcgtggaa-3’ (SEQ ID NO. I)
GAPDH456 53 NM—002046

5’ -aaattcgttgtcataccagg-3’ (SEQ ID NO. 2)

5’ -aaccaacacctgtgcggctc-3’ (SEQ ID NO. 3)
胰島素320 59 J00265
5，-aagggctttattccatctctctcg-3’ (SEQ ID NO. 4)
5’ -cgtgaactccttgaactgagcag-3’ (SEQ ID NO. 5) ngn3211 61 AF234829
5，-tggcactcctgggacgagtttc-3，(SEQ ID NO. 6)

5’ -cccatggatgaagtctacg-3’ (SEQ ID NO. 7) pdxl262 54 NM—000209
5，-gtcctcctcctttttccac-3’ (SEQ ID NO. 8)

5 ’-gaataccccccagagaccttttc-3 ’ (SEQ ID NO. 9)
GK182 61 M90299
5， -ggtttcttcctgagccagcg-3’ (SEQ ID NO.10)
5’ -agcatcaatgtcctctcaacttcc-3’ (SEQ ID NO.II)
Isll493 57 NM—002202
5， -tgtttggcaaggcaatgacc-3， (SEQ ID NO.12)
5， -acacgagacccactttttccg-3， (SEQ ID NO.13)
Nkx6.I336 59 NM—006168
5， -tgctggacttgtgcttcttcaac-3， (SEQ ID NO.14)
5， -agctttgcagttggtggaat-3’ (SEQ ID NO.15)
Glut 2300 57 NM—000340
5’ -aataagaatgcccgtgacga-3’ (SEQ ID NO.16)

5’ -cagaaccaggacatgccc-3’ (SEQ ID NO. 17)
ND216 60 NM—002500
5’ -atcaaaggaagggctggtg-3’ (SEQ ID NO.18)
膜同血糖 5，-atgaacgaggacaagcgc-3’ (SEQ ID NO. 19)



236 57 NM—002054
素5，-gtaacgaaccgaccactt-3，(SEQ ID NO. 20)
權(quán)利要求
1.將人類成體干細胞離體分化成胰島素分泌細胞的方法，包括 在包含20-30mM葡萄糖、補充有5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5-20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體干細胞4_10天；和在包含4-7mM葡萄糖、補充有5-20 %胎牛血清、5_20mM煙酰胺、I-IOnM激活素A、5-20nM胰高血糖素樣肽-I和10-100ng/ml胰島素樣生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述培養(yǎng)的干細胞10-20天。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子_2。
3.將人類成體干細胞離體分化成胰島素分泌細胞的方法,包括順序地培養(yǎng)成體干細胞 在包含20-30mM葡萄糖，補充有B27添加劑、10_30ng/ml成纖維細胞生長因子_2和10-30ng/ml表皮生長因子的培養(yǎng)基中1-7天； 在包含20-30mM葡萄糖，補充有5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養(yǎng)基中1_7天； 在包含4-7mM葡萄糖，補充有5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養(yǎng)基中1_7天；以及 在包含4-7mM葡萄糖，補充有5-20%胎牛血清、5-20mM煙酰胺、l-10ng/ml β細胞素和5_15ηΜ胰高血糖素樣肽的培養(yǎng)基中10-20天。
專利摘要
公開了將人類成體干細胞分化成胰島素分泌細胞的方法。將從眼睛周圍的皮下脂肪組織分離的人類成體干細胞，在存在細胞因子和生長因子包括B27添加劑，成纖維細胞生長因子-2，表皮生長因子，煙酰胺，胰高血糖素樣肽-1，激活素A，胰島素樣生長因子，β細胞素等的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞，所述培養(yǎng)基具有從高濃度至低濃度的葡萄糖轉(zhuǎn)變。具有高水平產(chǎn)生胰島素和C-肽的能力，所述胰島素分泌細胞可以為用于1型糖尿病的優(yōu)良治療物。
文檔編號GKCN101724602 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910207018
公開日2013年1月9日 申請日期2009年10月23日
發(fā)明者金海權(quán), 姜賢美 申請人:孔喜淑導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),