專利名稱:人α防御素5活性肽的基因工程制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領域，具體涉及一種具有殺滅細菌和抗病毒生物活性多肽-人α防御素5活性肽的基因工程制備方法。
背景技術：
當前細菌和病毒感染仍然是人類生命和健康的主要威脅。自上世紀早期青霉素和磺胺藥問世以來，人類已發(fā)明了近百種主要以干擾細菌的核酸或蛋白質(zhì)的代謝與合成或抑制細菌胞壁合成的機理達到抗細菌目的的抗菌素，然而由于這些傳統(tǒng)抗生素的作用機制容易誘導細菌發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性。臨床實踐中已發(fā)現(xiàn)針對傳統(tǒng)抗生素的多種耐藥菌株， 使得人類再次面臨致病細菌的挑戰(zhàn)。因此，人們一直在努力尋求與開發(fā)新型的抗菌素。另一方面，自從首例艾滋病病例的出現(xiàn)以來，又有SARS病毒、流感病毒、肝炎病毒、登革熱病毒等病毒所致疾病的暴發(fā)與流行，使得人類的生命時常面臨危機。由于病毒的基因很容易發(fā)生突變，病毒所致的損傷往往有宿主免疫系統(tǒng)的功能失誤參與，至今人們尚未尋找到可長期使用且具有特效抗病毒的藥物。因此除應用目前通過抑制病毒核酸或蛋白酶，或利用免疫因子殺傷病毒，或利用病毒疫苗免疫人體等機理生產(chǎn)的藥物外，還必須尋找其他更為高效低毒的抗病毒藥物。
經(jīng)過近二十年的研究，發(fā)現(xiàn)在植物、昆蟲和包括人在內(nèi)的高等動物機體內(nèi)存在近
千種內(nèi)源性陽離子肽------防御素(Defensin) (Shalin Seebah et al，Nucleic Acids
Research, 2007, 35 :262-268)。具有活性的防御素分子一般為3_6kD的非糖基化多肽，多數(shù)分子內(nèi)存在6 8個保守半胱氨酸殘基形成的3 4對鏈內(nèi)二硫鍵外，還富含精氨酸、 脯氨酸等特殊殘基，整個分子在中性溶液中帶正電荷；晶體衍射揭示防御素分子具有α螺旋、β折疊、二硫鍵橋、無規(guī)卷曲等單種或多種二級結(jié)構所形成的單體或多聚體空間結(jié)構。 根據(jù)二硫鍵等結(jié)構的組成方式，防御素被分為α、β和θ等類型。研究已證實，有805種防御素具有快速、強效地殺滅多種細菌的活性；有261種防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋體的作用；有48種防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有M種防御素可產(chǎn)生抗癌細胞的生物效應。此外，防御素作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與了免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能。研究顯示防御素的抗微生物活性與其結(jié)構相關，通過其所具有的凈電荷、疏水性與親水性、空間構象與極向角等因素構成的特征性機理殺傷細菌(Michiael R. et al, Pharmacol Rev, 2003, 55 :27-55)，因此防御素直接擾亂細菌胞膜的結(jié)構進而破壞胞膜的通透性和細胞能量狀態(tài)，導致細胞膜去極化、呼吸作用受抑制，以及細胞ATP含量下降，最終致靶細菌死亡。防御素的抗病毒作用則是通過與病毒衣殼中的靶分子結(jié)合而導致病毒失去感染宿主細胞的生物活性(E Hazrati et al，J Immunol，2006，177 :8659-8666)。 由于這些特殊的作用機理，使防御素具備兩個特點一是抗微生物譜廣，二是靶微生物難以對其產(chǎn)生抗性突變。因此，生物學家認為防御素可能成為一種新型的抗生素，在作為抗感染制劑、食品防腐劑等方面具有廣闊的應用前景。
迄今為止，相繼發(fā)現(xiàn)了 6種人α -防御素(HNP1_4，HD5，HD6)和6種人β -防御素(HBD1-6)。人α防御素5活性肽是分子量為3. 58KD的陽離子短肽，含保守的6個半胱氨酸殘基，構成3個分子內(nèi)二硫鍵，形成由3條穩(wěn)定的折疊片構成的兩歧性分子。研究發(fā)現(xiàn)，HD5除在人腸道潘氏細胞中大量分泌表達外；在生殖道上皮細胞、鼻粘膜和部分正常支氣管粘膜等細胞中存在固有表達，還可因炎癥、感染和細胞惡性轉(zhuǎn)變等因素的刺激而表達、 分泌上調(diào)。研究表明，化學合成、從粘膜組織中提取和轉(zhuǎn)基因小鼠表達的HD5不僅具有高效而廣譜的抑菌和參與免疫保護調(diào)節(jié)的活性，而且具有阻止HIV、HSV等病毒粘附進入細胞和抑制病毒顆粒復制的抗病毒作用(N. H. Salzman et al, Nature, 2003,422 :522-526 ；Bryan Ericksen et al, Antimicrobial Agent andChemotherapy, 2005 :269-275 ；C. B.Buck et al, Proc Natl Acad Sci，2006，103 :1516-1521)。由此可見，HD5 在消化道、生殖道等粘膜內(nèi)源性感染預防和免疫保護調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。另一方面，HD5是機體與病原微生物相互作用過程的進化產(chǎn)物，其具有特異識別與殺傷病原微生物的活性，理論上對人體不會產(chǎn)生免疫抗體等毒副效應，因此HD5是具有良好開發(fā)前景的新型抗病原微生物的藥物候選分子。
科學家們發(fā)現(xiàn)并證實了人α防御素及其生物活性，并進一步地認識了 HIV、HPV等病毒和細菌感染的發(fā)病機制Chang et al, Science, 2002, 298 :995)，為傳染病的防治提供了新的思路。但要將防御素真正應用于艾滋病等感染性疾病的治療和預防，尚有很多工作要做。從人體內(nèi)提純的天然α防御素5具有很強的抗菌活性，但提取材料稀缺，成本極昂貴。化學合成法可方便地獲得高純度的人α防御素5活性肽，但合成產(chǎn)品僅呈線性需經(jīng)過低效率的復性后才具有活性，故成本很高，且產(chǎn)量較低。因此，通過基因和蛋白質(zhì)工程技術來改善生產(chǎn)效率和產(chǎn)物活性，已成為防御素研究和應用的關鍵。
國外有數(shù)家制藥公司在進行防御素的開發(fā)研究，但現(xiàn)有公開的文獻表明因防御素分子太小、含特殊氨基酸較多及具有抗微生物活性等原因，目前制約防御素產(chǎn)品走上市場的主要瓶頸依然是尚未建立成本低廉、高效穩(wěn)定的制備工藝。
畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來興起的一種真核高效表達系統(tǒng)，具備獨特的優(yōu)點菌體自身分泌蛋白較少，外源目的基因通過整合進入酵母細胞基因組中，結(jié)構比較穩(wěn)定，特別是可對表達的外源蛋白進行翻譯后修飾和加工，如二硫鍵的形成、糖基化等，在表達外源基因方面應用越來越廣泛，并且已經(jīng)建立了操作簡單的合適培養(yǎng)方法。研究者也嘗試過用植物表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)等真核細胞制備抗菌肽。李元廣等成功地將兔α防御素基因?qū)胄∏蛟宀@得了有生物活性的NPl (專利申請?zhí)?3142195. 4，公開號cnl473846)。王興權等利用畢赤酵母成功地實現(xiàn)了 CecA-mag抗菌肽的分泌表達(王興權等，微生物學報， 2007,47:75-78)?；诋叧嘟湍副磉_系統(tǒng)的優(yōu)點和人α防御素5的生物活性需要空間結(jié)構(分子內(nèi)3對二硫鍵穩(wěn)定的β-折疊構象)的要求(E.de Leeuw et al, FEBSLett, 2007, 581 :515-520),理論上將采用特殊的技術構建人α防御素5重組表達載體并篩選出基因組中整合有高拷貝目的基因的酵母細胞轉(zhuǎn)化克隆，進而建立起高效表達和純化HD5活性肽的工藝，應該是一種理想的人防御素開發(fā)方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對未見有利用酵母菌株生產(chǎn)人α防御素5活性肽的報道和現(xiàn)有技術重組制備小分子多肽的不足，提供一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的高效表達含天然N-端序列人α防御素5活性肽和低成本、高效率純化制備活性多肽的方法，包括用于該方法的適宜 DNA序列、重組表達載體及其構建方法、酵母菌的高密度發(fā)酵與目的基因的誘導表達、發(fā)酵上清中目的肽的分離純化方法和工藝主要技術路線。
本發(fā)明所述的人α防御素5活性肽的制備方法，主要包括以下步驟
1)目的基因的獲取克隆人α防御素5的cDNA編碼序列，序列如SEQ IDNO :1所示；
2)將步驟1)所得目的基因插入穿梭質(zhì)粒中，構建重組表達質(zhì)粒；
3)將步驟2~)所得重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細胞中，篩選出基因組中整合有多拷貝目的基因的酵母克隆株；
4)高密度培養(yǎng)步驟3)所篩選的酵母克隆株，并用甲醇誘導目的基因的高效表達；
5)從步驟4)獲得的發(fā)酵上清中分離純化人α防御素5活性肽。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟1)目的基因的獲取還包括設計合成寡核苷酸引物 SEQ ID NO 7-9并克隆含SEQ ID NO 2所示序列的DNA0
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟1)所述克隆人α防御素5的cDNA編碼序列時使用克隆引物，該克隆引物如SEQ ID NO :3-4所示。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟2)所述穿梭質(zhì)粒為pPIC9K。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟2)中重組表達質(zhì)粒為PPIC9K-HD5和/或 pPIC9K-mHD5。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟幻包括采用限制性內(nèi)切酶Mc I將步驟2)所得重組表達質(zhì)粒酶切獲得具有可發(fā)生多次單交換同源重組以致于多拷貝目的基因整合入酵母細胞基因組的游離AOiC1 5’端的線型化重組表達質(zhì)粒。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟幻包括采用兩次電擊轉(zhuǎn)化方法將線型化重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細胞中，然后利用G418抗性表型和組氨酸合成能力與甲醇利用能力表型篩選獲得基因組中整合有多拷貝目的基因的酵母克隆株，。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟幻所述酵母為畢赤巴斯德酵母菌株GS115。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟4)包括采用生物發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)步驟幻所篩選的酵母克隆株，并用甲醇誘導目的基因的表達，采用高效液相色譜層析法連續(xù)監(jiān)測目的肽的含量，以獲得高效表達目的肽的發(fā)酵上清。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟4)中采用生物發(fā)酵罐時，發(fā)酵溫度控制在觀 30 V，溶解氧含量控制在30 % 40 %之間，pH值控制在3. 5 5. 0。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，步驟幻包括采用捕獲純化、組分分離純化和精純化3個步驟從步驟4)所獲發(fā)酵上清中分離純化人α防御素5活性肽。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，捕獲純化步驟包括應用超速離心沉淀分離法、連續(xù)超濾更換緩沖溶液(脫鹽)法和大孔樹脂吸附層析(脫鹽、除色素)法；組分分離步驟包括應用離子交換層析和疏水層析法；精純化步驟包括應用反相層析和分子篩層析法。
本發(fā)明所克隆的HD5序列(SEQ ID NO 1)與NCBI基因庫中DEFA5 (GeneID 1670) 同源。經(jīng)生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)HD5的活性肽堿基序列中含有多個畢赤酵母使用的稀有密碼子(表1)，為提高目的基因在酵母細胞中的表達效率，經(jīng)基因優(yōu)化設計改造獲得可翻譯出正確人α防御素5活性肽的DNA序列mHD5 (SEQ ID NO :2)。[0027]人α防御素5基因(GeneID 1670)在粘膜細胞中先翻譯成前原防御素 5(preprodefensin 5，NP 066290. 1),再裂解、加工并分泌出胞外變成具有牛物活件的活件肽(表1)。人體內(nèi)防御素的這種生成方式是機體隨環(huán)境變化而作出適應性反應的進化機制 (D. Elphick et al, Am J Pathol,2008，172 :702-713)
表1人α防御素5及其活性肽編碼序列和活性肽氨基酸序列
種類堿基序列氨基酸序列
人α 防 ATG AGG ACC ATC GCC ATC CTT GCT MRTIAILAAILLVALQA
御素5 GCC ATT CTC CTG GTG GCC CTG CAG
QAESLQERADEATTQKQ
CDs GCC CAG GCT GAG TCA CTC CAG GAA
SGEDNQDLAISFAGNGL
AGA GCT GAT GAG GCT ACA ACC CAG
SALRTSGSQARATCYCR
AAG CAG TCT GGG GAA GAC AAC CAG
GAC CTT GCT ATC TCC TTT GCA GGA TGRCATRESLSGVCEIS
AAT GGA CTC TCT GCT CTT AGA ACC GRLYRLCCR
TCA GGT TCT CAG GCA AGA GCC ACC
TGC TAT TGC CGA ACC GGC CGT TGT
GCT ACC CGT GAG TCC CTC TCC GGG
GTG TGT GAA ATC AGT GGC CGC CTC
TAC AGA CTC TGC TGT CGC TGA
GCC ACC TGC TAT TGC CGA ACC GGC A T C Y C R T G R C A T
人 α 防 CGT TGT GCT ACC CGT GAG TCC CTC R E S L S G V C E I S G
御素5 TCC GGG GTG TGT GAA ATC AGT GGC R L Y R L C C R
活性肽CGC CTC TAC AGA CTC TGC TGT CGC
TGA
注劃底線部分字符標識人α防御素5活性肽編碼序列中的畢赤酵母使用稀有密碼子。
為了提高目的基因在酵母細胞中的表達量，本發(fā)明選用可將多拷貝目的基因整合入宿主細胞基因組中的表達載體PPIC9K。另一方面，本發(fā)明選用具有很強分泌功能的釀酒酵母α因子(α -factor)作為目的基因的信號肽，以確保表達的目的肽成功地被分泌到培養(yǎng)基中，為其翻譯后的正確修飾(空間結(jié)構形成)和分離純化創(chuàng)造了條件。釀酒酵母分泌信號肽(a -factor)與HD5活性肽組成融合蛋白的優(yōu)化編碼子序列閱讀框，其中α -factor DNA序列位于融合蛋白的N-端，HD5活性肽DNA序列位于融合蛋白的C-端，序列如SEQ ID NO 10所示；釀酒酵母分泌信號肽(α -factor)與HD5活性肽組成融合蛋白的氨基酸序列， 其中α-factor位于融合蛋白的N-端，HD5活性肽位于融合蛋白的C-端(C-端含信號肽酶KEX2切割位點)，序列如SEQ ID NO 11所示；HD5的氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示； HD5活性肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:13所示。因此，本發(fā)明構建了 2種優(yōu)選表達載體 PPIC9K-HD5 (圖 1)禾口 pPIC9K_mHD5 (圖 2)。[0052]基于體內(nèi)人α防御素5活性肽是由潘氏細胞內(nèi)胰蛋白酶裂解前原防御素5后分泌出具有活性的活性肽之機制(D.Ghosh et al，Nat Immunol，2002，3 :583-590)，優(yōu)選載體 PPIC9K-HD5首先表達出具有94個氨基酸殘基的蛋白，該蛋白因分子量約為10. OkDa有利于將其從發(fā)酵上清中分離純化，然后應用價格低廉的胰蛋白商品酶切割出具有活性的活性肽，最后經(jīng)陽離子交換層析即可獲得高純度的人α防御素5活性肽。
根據(jù)目前公認的密碼子數(shù)據(jù)庫(http//www. kazusa. or. jp/codon)對靶基因進行分析，發(fā)現(xiàn)人α防御素5天然活性肽中含有13個畢赤酵母細胞使用頻率小于8.2%的稀有密碼子，比例高達40. 6%。為確保目的基因在宿主細胞中成功地高效表達，本發(fā)明利用Leto vl. 0軟件對目的肽堿基進行了同義密碼子替換的多次優(yōu)化，獲得了酵母細胞使用頻率均大于13. 7 %的優(yōu)化序列mHD5 (SEQ IDNO 2)。優(yōu)化序列中還含有包括TAA在內(nèi)的雙終止子，并配置了有利于翻譯正常終止的側(cè)翼序列，TAAG的序列格式將最大限度地防止不良終止效應的發(fā)生。針對現(xiàn)有公開文獻中所用的技術只能表達含多個額外氨基酸的多肽之不足，本發(fā)明應用改進的Red/ET技術成功將mHD5序列重組入pPIC9K中被信號肽酶切割導肽位點的下游閱讀框，構建可表達含天然N-端氨基酸序列的活性肽之表達載體pPIC9K-mHD5。因此， 本發(fā)明的設計為高效表達具有強生物活性的目的肽奠定了首要基礎。
針對游離質(zhì)粒在甲基營養(yǎng)型酵母中不能存活，載體必須和宿主細胞基因組中的同源區(qū)發(fā)生重組整合后才能實現(xiàn)外源蛋白穩(wěn)定表達的特點和現(xiàn)有公開文獻中真核表達系統(tǒng)效率低的不足，本發(fā)明選用限制性內(nèi)切酶I切割重組表達載體，使之線型化后產(chǎn)生可發(fā)生多次單交換同源重組以致于多拷貝目的基因整合入宿主細胞基因組的游離AOX1 5’端。 該種重組方式同時將His4基因帶入宿主菌GS115(His_，Mut+)的染色體中，有利于篩選出具有HisYMut+表型和對G418高濃度抗性的陽性重組克隆。本發(fā)明應用改進的真核細胞電擊轉(zhuǎn)化法和采用“兩次電擊轉(zhuǎn)化”策略(即重復電擊一次)，確保了重組表達載體至少有兩次同源重組的機會整合到宿主細胞基因組中，為確保獲得高拷貝目的基因整合宿主細胞克隆和目的蛋白的高效表達奠定了良好基礎。
本發(fā)明還提供了含目的基因(HD5和或mHD5)的酵母克隆在生物發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵和利用甲醇誘導目的蛋白高效表達的方法。將凍存的種子工程菌復蘇后傳代擴增，再接種到生物發(fā)酵罐，應用溶解氧循環(huán)連動控制發(fā)酵罐的技術和發(fā)酵液中甲醇含量實時監(jiān)測的方法，聯(lián)合采用高效液相色譜層析法連續(xù)監(jiān)測目的肽含量的策略，確保了獲得高效表達目的肽的發(fā)酵上清。
本發(fā)明首次提供了用畢赤酵母菌重組表達、制備人α防御素5活性肽的方法。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(1)核苷酸序列的優(yōu)異性。與人α防御素5活性肽的天然編碼序列相比，本申請要求保護的堿基序列是經(jīng)過生物信息學分析并進行大幅度修飾優(yōu)化后獲得的(改變了近 80%的核苷酸序列，優(yōu)化了終止密碼子及側(cè)翼序列)，具有更高的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，更適合基因工程系統(tǒng)的表達。
(2)本申請中要求保護的重組質(zhì)粒的構建、表達載體的轉(zhuǎn)化與基因組中整合有多拷貝目的基因的工程酵母菌株克隆的篩選及其在生物發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵與目的肽的高效誘導表達體系，彌補了現(xiàn)有技術僅能低效表達N-端含多個額外氨基酸多肽之不足，實現(xiàn)了具有較強生物活性的人α防御素5活性肽的高效表達，具有新穎性和創(chuàng)造性。[0059](3)本發(fā)明提供的從酵母發(fā)酵上清中分離純化多肽的方法，解決了已公開文獻中所用技術不能消除色素和高鹽離子強度的干擾純化獲得高純度活性多肽的難題，實現(xiàn)了人 α防御素5活性肽的大規(guī)模、低成本、高效率的純化制備，可滿足制藥需求量的生產(chǎn)。
(4)本發(fā)明提供的技術產(chǎn)品為人源性活性多肽，應用于醫(yī)學領域時比動物源性的防御素更安全，不易發(fā)生人體免疫應答反應等副作用，因此保證了更好的疾病預防和治療效果。
本發(fā)明首次解決了利用真核細胞表達、制備具有較強生物活性人α防御素5活性肽的技術難題。通過畢赤酵母菌分泌性高效表達和創(chuàng)新的分離純化工藝，為人α防御素5活性肽的生產(chǎn)提供了新途徑，將在一定程度上解決該多肽來源不足的現(xiàn)狀。本發(fā)明成果不僅可滿足對人α防御素5的生化性質(zhì)、結(jié)構與功能關系及其與疾病發(fā)生和作用機制的研究需要，還使人α防御素5的藥用開發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)成為可能。新型抗微生物制劑的生產(chǎn)，將為目前臨床中發(fā)生的針對傳統(tǒng)抗生素之耐藥菌株和突變病毒株感染所致疾病的預防和治療提供新思路和新方法。
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明。


圖1為pPIC9K-HD5重組表達質(zhì)粒的構建示意圖。
圖2為pPIC9K_mHD5重組表達質(zhì)粒的構建及其整合入酵母菌細胞基因組后的表達框示意圖。
圖3為人α防御素5活性肽在高密度發(fā)酵過程中誘導表達量的 Tricine-SDS-PAGE 分析結(jié)果。
圖4為純化制備的重組人α防御素5活性肽Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)果。
圖5為重組人α防御素5活性肽產(chǎn)品抑制HPV16感染HeLa細胞效果的分析結(jié)
^ ο
具體實施方式
材料
1. RNAiso Reagent (總 RNA 提取試劑)、One Step RNA PCR Kit (RT-PCR 試劑盒)、 Pyrobest DNA Polymerase試劑盒(TaKara公司產(chǎn)品，中國大連)
2. pMD18-T載體克隆試劑盒、T4DNA連接酶(TaKara公司產(chǎn)品，中國大連)
3. SnaB I、Not I、EcoR I、Sac I 等內(nèi)切酶(New England BioLabs 公司產(chǎn)品，美國)
4.質(zhì)粒載體PPIC9K、畢赤酵母菌株GS115anvitrogen公司產(chǎn)品，美國)
5. Red/ET 重組酶 red y /red β /red a /redA 質(zhì)粒 pSClOl-BAD-gbaA、大腸桿菌 HS996、pl6Ll-L2、pFWB 質(zhì)粒 O^ene Bridges 公司產(chǎn)品，德國)
6.大腸桿菌DH5 α等其它實驗用細菌株(本室保存)
7. HeLa細胞株、293FT細胞株(本室保存)
8. G418、卡那霉素、氨芐青霉素(Roche公司產(chǎn)品，德國)[0077]9. SP Sepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow、Source 30RPC、GlO 等層析介質(zhì)(GE Healthcare Bio-Science s公司產(chǎn)品，美國)
10. FINELINE PILOT 35 層析柱(GE Healthcare Bio-Sciences 公司產(chǎn)品，美國)
11.酵母提取物、胰蛋白胨、無氨基酸酵母氮源(Oxford公司產(chǎn)品，美國)
12. LB 培養(yǎng)基
酵母提取物5g
胰蛋白胨IOg
NaClIOg
溶于1000ml去離子水中，并用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0，高壓蒸氣滅菌。
13. YPD液體培養(yǎng)基
酵母提取物2g
胰蛋白胨4g
溶于180ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻后加入20ml經(jīng)濾器除菌后的20%的右旋糖和0.2ml濃度為100mg/ml氨芐青霉素。
14. BMGY液體培養(yǎng)基
酵母提取物IOg
胰蛋白胨20g
無氨基酸酵母氮源13. 4g
甘油IOg
磷酸鉀26. 63g
溶于1000ml雙蒸水中高壓滅菌，冷至室溫后補加生物素至終濃度為4X 10_5/L，氨芐青霉素終濃度為100μ g/ml，調(diào)節(jié)pH至6. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?br>15. BMMY液體培養(yǎng)基
酵母提取物IOg
胰蛋白胨20g
無氨基酸酵母氮源13. 4g
磷酸鉀26. 63g
溶于950ml雙蒸水中高壓滅菌，冷至室溫后補加甲醇12. 66ml，補加生物素至終濃度為4X10_5/L、氨芐青霉素終濃度為100 μ g/ml，調(diào)節(jié)pH至6. 0，補雙蒸水至1000ml。
16.磷酸鹽緩沖液
NaCl8g
KCl0. 2g
Na2HPO41. 44g
KH2PO40. 24g
溶于1000ml去離子水中，并用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，高壓蒸氣滅菌。
16.發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基
基礎鹽培養(yǎng)基配方微量鹽PTM1配方
權利要求
1.一種人α防御素5活性肽的基因工程制備方法，其特征在于包括步驟1)目的基因的獲取設計合成寡核苷酸引物SEQID NO :7-9并重疊延伸擴增出SEQ ID NO 2所示序列的DNA ；2)將步驟1)所得目的基因，與線性化PPIC9K共轉(zhuǎn)化，通過Red/ET同源重組構建重組表達質(zhì)粒；3)將步驟幻所得重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細胞中，篩選出基因組中整合有多拷貝目的基因的酵母克隆株，所述酵母為畢赤巴斯德酵母菌株GS115 ；4)高密度培養(yǎng)步驟幻所篩選的酵母克隆株，并用甲醇誘導目的基因的高效表達；5)從步驟4)所獲得的發(fā)酵上清中分離純化人α防御素5活性肽。
2.根據(jù)權利要求
1所述的方法，其特征在于步驟3)包括采用限制性內(nèi)切酶MeI酶切步驟2)所述重組表達質(zhì)粒，獲得具有可發(fā)生多次單交換同源重組以致于多拷貝目的基因整合入酵母細胞基因組的游離AOXl 5’端的線型化重組表達質(zhì)粒。
3.根據(jù)權利要求
2所述的方法，其特征在于步驟幻包括采用兩次電擊轉(zhuǎn)化方法將線型化重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細胞中，再利用G418抗性表型和組氨酸合成能力與甲醇利用能力表型篩選獲得基因組中整合有多拷貝目的基因的酵母克隆株。
4.根據(jù)權利要求
1所述的方法，其特征在于步驟4)包括采用生物發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)權利要求
3所述的酵母克隆株和用甲醇誘導目的肽的表達，采用高效液相色譜層析法連續(xù)監(jiān)測目的肽的含量，以獲得高效表達目的肽的發(fā)酵上清。
5.根據(jù)權利要求
4所述的方法，其特征在于步驟4)中采用生物發(fā)酵罐時，發(fā)酵溫度控制在28 30°C，溶解氧含量控制在30% 40%之間，pH值控制在3. 5 5. 0。
6.根據(jù)權利要求
1所述的方法，其特征在于步驟幻包括采用捕獲純化、組分分離純化和精純化3個步驟從權利要求
4所述的發(fā)酵上清中純化獲得人α防御素5活性肽；所述捕獲純化步驟包括應用超速離心沉淀分離法、連續(xù)超濾更換緩沖溶液法；所述組分分離純化步驟包括應用陽離子交換層析；所述精純化步驟包括應用反相層析法。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種人α防御素5活性肽的基因工程制備方法。本發(fā)明公開了含人α-防御素5活性肽基因的表達載體構建及其轉(zhuǎn)化酵母克隆株的篩選、高密度發(fā)酵的方法和從發(fā)酵上清中分離純化活性多肽的方法。本發(fā)明還公開了由上述方法獲得的人α防御素5活性肽在多肽藥物制備中的應用。本發(fā)明適用于工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模中經(jīng)過簡單的操作實現(xiàn)高效發(fā)酵表達和低成本、高效率地純化制備具有高效殺滅多種病原細菌和抗HPV等病毒的人α防御素5活性肽。
文檔編號C12P21/02GKCN101525629 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200910103227
公開日2012年6月6日 申請日期2009年2月23日
發(fā)明者王軍平, 王崧, 王艾平, 申明強, 程天民, 粟永萍, 陳默 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4),