專利名稱：一種活性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種活性肽，特別涉及一種具有促進血小板生成功能的活性肽。
血小板生成素，簡稱TPO，是一種作用于巨核細胞——血小板系統(tǒng)的細胞因子，它能夠誘導巨核細胞分化，最終使血循環(huán)中的血小板數(shù)量升高。血小板生成素對于提高血循環(huán)中血小板數(shù)量是相當有效的，做為一個含332氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，它也存在著免疫原性強，制做成本高，不能口服等方面的不足。近年來，國外有單位報道得到了分別具有促進血小板生成活性和促進紅細胞生成作用的活性肽，如1997年美國的Steven E等人報道從肽庫中篩選出一種具有與TPO促血小板生成功能相似的活性肽，其結(jié)構(gòu)式為IEGPTLRQWLAARA，其單體作用于Ba/F3-mpl依賴株細胞的EC50為400nmol/L，二聚體為100pmol/L，用藥量為250μg/Kg/天時，能刺激小鼠血循環(huán)中血小板數(shù)升高；但這種結(jié)構(gòu)的活性肽的不足是活性偏低，難以滿足實際需要。
本發(fā)明的目的在于提供一種活性提高的具有促進血小板生成功能的活性肽。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的采用多肽固相合成法設計合成的活性肽單體的序列為IEGPTLRQWLAARAC，在該活性肽的C端進行酰胺化修飾后形成的肽鏈結(jié)構(gòu)為IEGPTLRQWLAARAC-NH2，利用單體肽鏈羧基端的半胱氨酸進行分子間氧化形成的二聚體結(jié)構(gòu)為
采用了上述結(jié)構(gòu)的活性肽，具有以下優(yōu)點1.本活性肽單體與公知活性肽鏈IEGPTLRQWLAARA相比，由于在公知肽鏈單體結(jié)構(gòu)中加入了一個半胱氨酸，以支持Ba/F3-mpl細胞生長的EC50值表示，活性提高了20倍，即EC50≤20nmol/L。
2.在本活性肽單體的C端進行酰胺化修飾后形成的酰胺化肽鏈IEGPTLRQWLAARAC-NH2的活性比單體肽鏈提高了10倍，即EC50≤2nmol/L。
3.利用單體肽鏈羧基端的半胱氨酸進行分子間氧化形成二聚體
其活性比單體提高了100倍，即EC50≤200pmol/L。
4.分別用本活性肽單體和酰胺化肽鏈進行小鼠體內(nèi)試驗，當給藥量分別為≤230μg/Kg/天和≤140μg/Kg/天時，可以顯著提高小鼠血循環(huán)中的血小板數(shù)，活性較公知活性肽有所提高。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
A.合成肽鏈(1)使用Perkin-Elmer公司的ABI 433A型多肽合成儀、選用Fmoc/HOBt/DCC0.10mmol模式，采用多肽固相合成法進行活性肽單體和酰胺化肽鏈的合成，合成中所用氨基酸用Fmoc保護，合成用樹脂為HMP樹脂。合成結(jié)束后用含0.75g結(jié)晶酚，0.25ml二巰基乙醇，0.5ml硫代苯甲醚，0.5ml去離子水，10mlTFA三氟乙酸的切割試劑將肽從樹脂上切割下來。用反相高效液相色譜，在C18柱上進行肽的純化。
(2)制備活性肽二聚體在合成的活性肽序列中有一個半胱氨酸(Cys)，利用兩條肽鏈中Cys上的-SH氧化形成二硫鍵-S-S-，從而得到活性肽的二聚體形式。
B.活性測定(1)四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測多肽支持TPO依賴株Ba/F3-mpl細胞生長的活性
先將需要測活的多肽樣品用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基溶解后，進行系列稀釋。取生長旺盛的對數(shù)期Ba/F3-mpl細胞，用不含TPO和血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，再用不含TPO的上述傳代培養(yǎng)用培養(yǎng)基將細胞配成1.2×106細胞/ml的懸液。按每孔80μl的量將上述單細胞懸液加到96孔培養(yǎng)板中，然后每孔中加入20μl待測樣品，每個稀釋度3個平行，以無TPO、含10％胎牛血清的培養(yǎng)基為對照。96孔培養(yǎng)板置37℃、5％CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，每孔加入10μL5mg/ml的MTT溶液(溶于PBS中)，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中。4小時后取出培養(yǎng)板，從每孔中吸出80μL上清液并棄去，然后加入100μL二甲亞砜，振蕩均勻后以630nm處吸光值作對照，檢測492nm處的吸光值。
(2)體內(nèi)活性測定將多肽樣品溶于2mg/ml人白蛋白/PBS中，進行系列稀釋。根據(jù)體重將小鼠隨機分組，以2mg/ml人白蛋白/PBS為對照組，每種肽濃度作為一組，各組小鼠數(shù)均為8只，雌雄各半。采用皮下注射方式，每日上午830～930給藥一次，每次0.1ml/只，連續(xù)給藥5天。分別在給藥前、給藥3、5、7、9天由尾靜脈取血，檢測外周血白細胞、紅細胞、血小板計數(shù)、血紅蛋白含量及平均血小板體積。將原始數(shù)據(jù)按組別輸入Microsoft Excel中，各組結(jié)果以算術(shù)平均數(shù)(x)±標準差(s)表示，用Student t檢驗進行各用藥組均數(shù)與對照組之間差異顯著性檢驗。
權(quán)利要求
1.一種活性肽，其特征在于肽序列為IEGPTLRQWLAARAC。
2.一種如權(quán)利要求1所述的活性肽，其特征在于酰胺化肽鏈結(jié)構(gòu)為IEGPTLRQWLAARAC-NH2。
3.一種如權(quán)利要求1所述的活性肽，其特征在于二聚體結(jié)構(gòu)為
全文摘要
本發(fā)明公開了一種活性肽,特別涉及一種具有促進血小板生成功能的活性肽。解決了目前公知的活性肽中存在的活性偏低的不足。本發(fā)明采用多肽固相合成法設計合成了活性肽單體的序列為IEGPTLRQWLAARAC,酰胺化肽鏈結(jié)構(gòu)為IEGPTLRQWLAARAC－NH
文檔編號C07K14/49GK1254718SQ9812501
公開日2000年5月31日 申請日期1998年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月20日
發(fā)明者程度勝, 李朝, 黃培堂, 周艷榮, 陳添彌 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所