專利名稱：：一種活性單肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制肽以及它的類似物，或者其鹽類中的一種所構(gòu)成的ACE抑制劑，具體地說是一種從牡蠣可溶蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到的活性單肽及其應(yīng)用。技術(shù)背景高血壓是最常見的心血管疾病之一，長期的高血壓能引起動脈硬化、心絞痛、心肌梗塞、終末期腎病等多種疾病，嚴重威脅著全世界15—20%的成年人的身體健康。因此，治療和預防高血壓對提高人類的健康水準，延長壽命有著重要的意義。血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(angiotensinIconvertingenzyme,略稱為ACE)是一種Zn2+依賴型二肽外切肽酶，在人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，對血壓調(diào)節(jié)起著重要的作用。ACE可以將血管緊張素I轉(zhuǎn)換為血管緊張素II，使周圍小動脈、血管平滑肌收縮，同時刺激醛固酮分泌，促進人體腎臟對Na+、K—的重吸收，引起鈉儲量和血容量的增加，使血H;:升高；還可以使舒緩激肽失活，引起血壓升高。因此ACE抑制劑的研究是開發(fā)高血壓藥物的熱點?，F(xiàn)有的作為治療高血壓的合成物如卡普托利、愛諾普利等ACE的抑制劑均具有很多副作用，而源于食品蛋白的ACE抑制活性肽無毒副作用，市場前景好。曾經(jīng)有人從牛的脊髓中分離純化得到與本文所提到的序列相同的九肽(見5/oc/2em/cfl/Sfop/2j^s7'ca/iasearc/7Commww/caf/ow51，Volume202,Issue1，15My1994，Pages410-415)，并研究討論了此九肽的阿片活性，然而，對于此活性單肽的ACE抑制活性至今尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種由食品來源的、高安全性的、廉價的、具有可產(chǎn)業(yè)化的活性單肽及其應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種活性單肽，其具有序列表NO.l的氨基酸序列。所述的活性單肽及其鹽類，它們具有ACE抑制活性，可在制備治療和預防高血壓藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明相關(guān)的ACE抑制劑，使用量是沒有特別的限制，具體的要報據(jù)高血壓的程度，患者的年齡，體重，身體狀況和給與的方法等因素，適"1地確定。所述藥物可為活性單肽及其鹽類與充填劑所形成的各種形式的散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、水溶液、懸浮液、乳化液、噴劑或粉劑，通過U腔攝取或者是注射液的形式使用；其使用可以采取經(jīng)口腔和非經(jīng)口腔的投入方法非經(jīng)口腔的投入可以采取皮下和靜脈注射，肛腸投入等；注射液的制作可以任意選用生理鹽水、葡萄糖、安定劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑等。所述藥物可以添加到各種食品當中，作為抑制血壓保健食品。食品的形態(tài)可以是液體的，比如像清涼飲料、乳酸飲料、調(diào)味品、湯類、同體的奶酪、火腿、點心等。所述活性單肽及其鹽類是從牡蠣可溶蛋白中分離得到的。將新鮮牡蠣去殼，除內(nèi)臟，將白色肌肉、鰓和體液用勻漿機在低溫狀態(tài)下切碎后，將其加到等體積的PBS(0.2mol/LNaH2P04和0.2mol/LNa2HP04按體積比39:61混合，pH7.0)緩沖液中，充分攪拌。于4。C條件下，靜置6小時后，離心(5000Xg，4°C)25分鐘。取上清液，加入硫酸銨，并使其最終濃度達到75%，并在4。C條件下，靜置6小時，離心(5000Xg，4°C)25分鐘。將沉淀與少量水混溶，裝入透析袋(MW10000)。流水透析24小吋,再用去離子水透析24小時，然后將內(nèi)容物真空冷凍干燥，得到牡蠣可溶蛋白。牡蠣可溶蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解24小時后，酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾(取分子量小于10000道爾頓的組分)后，采用SephadexLH-20，流動相為30%的甲醇，柱溫為室溫，檢測波長為280nm，按時間收集。經(jīng)SephadexLH-20分離后得到的具有ACE抑制活性的組分在經(jīng)C,8高效液相色譜分離純化，分離條件為流動相A液為含O.P/。TFA的水溶液，用前超聲脫氣；流動相B液為:100X的乙腈，檢測波長215nm，室溫，進樣體積20^1，采川梯度洗脫，按時間收集。洗脫梯度0-40minA液100%-0%線性降低；B液0%-100%線性升高，40-50minA液0%;B液100%。從牡蠣可溶蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到的活性單肽，高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)測定此活性肽的分子量為1195道爾頓，經(jīng)氨基酸測序儀檢測(Model491,AppliedBiosystems,USA)其氨基酸序列為纈氨酸-纈氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-蘇氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-苯丙氛酸(Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe;VVYPWTQRF)。本發(fā)明通過對牡蠣可溶蛋白酶解液的進一步分離、純化得到了其氨基酸序列為VVYPWTQRF的肽，是有效的ACE抑制劑。檢測了人工合成的VVYPWTQRF對ACE抑制活性，證明它對ACE具有較強的抑制作用。上述肽及肽的類似物的鹽類可以用通常的方法生產(chǎn)。公認的與酸反應(yīng)產(chǎn)生的鹽類，比如說鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸；蟻酸、乙酸、W酸、甘氨膽酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸等有機酸等形成的鹽類；公認的與金屬離子形成的鹽類，包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鉸鹽；以及氨基乙醇、二乙氨、二環(huán)乙氨等形成的胺類鹽等沒有特別的限制。本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代酶催化技術(shù)對牡蠣可溶蛋白進行酶解，利用生物分子分離技術(shù)對具有ACE抑制活性較強的部分進行分離純化，對純化得到的單肽進行氨基酸序列分析，并研究了此肽在體內(nèi)、體外對ACE抑制活性的穩(wěn)定性，結(jié)果表明此肽有較強的降血壓效果。圖1為SephadexLH-20柱分離酶解產(chǎn)物液相圖譜；圖2為用RP-HPLCHypersilC18柱分離寡肽圖譜；圖3為純化的九肽濃度與ACE抑制活性關(guān)系曲線。具體實施方式卜'面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的闡述實施例l牡蠣可溶蛋白的制備將新鮮牡蠣去殼，除內(nèi)臟。留存的白色蠣肉、鰓和體液用勻漿機在低溫狀態(tài)下切碎。之后，將其加到等體積的PBS(0.2mol/LNaH2POjn0.2mol/LNa2HP04按體積比39:61混合，pH7.0)中，充分攪拌。于4。C條件下，靜置6小時后，離心(5000Xg，4°C)25分鐘。取上清液，加入硫酸銨，使其最終濃度達到75%，并在4。C條件下，靜置6小時，離心(5000Xg，4°C)25分鐘。將沉淀與少量水混溶，裝入透析袋(MW10000)。流水透析24小時,再用去離子水透析24小時，然后將內(nèi)容物真空冷凍干燥，得到牡蠣粗蛋白粉末，-20°(:保存。實施例2牡蠣可溶蛋白的酶解牡蠣可溶蛋白溶于0.05mol的礴酸緩沖液中(用lmol/L的HC1調(diào)pH2.0)，蛋白濃度2.5%，酶與底物的比，加入胃蛋白酶，酶與底物的比為l:50(質(zhì)量比)，在37。C下酶解24小時。所得酶解液加熱至100°C，并保持10分鐘，使蛋白酶失活。之后調(diào)節(jié)水解液pH為中性，離心(5000Xg，室溫)25分鐘，經(jīng)超濾膜(MW10000)過濾，透過超濾膜的組分，進行真空冷凍干燥，為牡蠣寡肽，-20°<:保存。實施例3牡蠣寡肽的分離由牡蠣可溶蛋白酶解液15ml經(jīng)SephadexLH-20柱進行層析分離(如圖1所示)，用30%的甲醇溶液洗脫，按管數(shù)收集，20分鐘/管，收集具有較強ACE抑制活性的部分繼續(xù)在RP-HPLC上分離純化(如圖2所示)，。在RP畫HPLC上用Hypersil(318柱，流動相A液為0.1%TFA的水溶液，川前超聲脫氣；流動相B液為100%的乙腈，檢測波長215nm，室溫，進樣體積20pl，采用梯度洗脫，按時間收集。洗脫梯度0-40minA液100%-0%線性降低；B液0%-00%線性升高，40-50minA液0%;B液100%。獲得的活性單肽，具有序列表NO.l的氨基酸序列。測定此活性肽的分子量為1195道爾頓，經(jīng)氨基酸測序儀檢測(Model491,AppliedBiosystems,USA)其氨基酸序列為纈氨酸-纈氨酸-酪氨酸-脯氣酸-色氨酸-蘇氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-苯丙氨酸(Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe;VVYPWTQRF)。其空間結(jié)構(gòu)為線性單鏈，九個氨基酸，最初來源為牡蠣(Ostrea(Crassostrea))，特性名稱為PEPTIDE。實施例4ACE抑制活性的檢測原理ACE可把Hip-His-Leu降解成Hip和His-Leu，通過高效液相色譜在228nm的波長下檢測Hip(馬脲酸)含量來計算樣品對ACE活性的變化。實驗方法在5uL樣品中，加入5uL的ACE酶，5min后力口25uL底物，30min后加5uL的TFA(三氟乙酸)，上述操作過程全部在37t恒溫條件下進行。流動相的配制300mL甲醇加入0.5mL冰醋酸和lmL10%的丁FA，用蒸餾水定容至1000mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH至3.3。具體實驗將合成EH]VVYPWTQRF分別配制不同Ak度檢測ACE抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>如圖3所示，經(jīng)計算最終IC50=0.079mg/ml=79|iig/ml=0.066pmol/ml序列表SEQUENCELISTING<110>中國科學院大連化學物理研究所U20>—種活性爭教及其應(yīng)用〈130><160〉1〈170>PatentInversion3.1〈210〉1〈211〉9〈212〉PRT〈213>Ostrea(Crassostrea)〈220>〈221〉PEPTIDE<222〉(1)..(9)〈223〉〈400〉1ValValTvrProTrpThrGinArgPhe1權(quán)利要求1.一種活性單肽，其特征在于其具有序列表NO.1的氨基酸序列。2、一種權(quán)利要求1所述的活性單肽及其鹽類，它們具有ACE抑制活件，可在制備治療和預防高血壓藥物中的應(yīng)用。3、按照權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于所述活性單肽及其鹽類是從牡蠣可溶蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到的。4、按照權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于所述藥物可為活性單肽及其鹽類與充填劑所形成的各種形式的散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、水溶液、懸浮液、乳化液、噴劑或粉劑。5、按照權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于所述藥物可以添加到各種食品當中，作為抑制血壓保健食品。全文摘要本發(fā)明涉及血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制肽以及它的類似物，或者其鹽類中的一種所構(gòu)成的ACE抑制劑，具體地說是一種從牡蠣可溶蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到的活性單肽及其應(yīng)用，其具有序列表NO.1的氨基酸序列。本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代酶催化技術(shù)對牡蠣可溶蛋白進行酶解，利用生物分子分離技術(shù)對具有ACE抑制活性較強的部分進行分離純化，對純化得到的單肽進行氨基酸序列分析，并研究了此肽在體內(nèi)、體外對ACE的抑制活性及穩(wěn)定性，結(jié)果表明此肽有較強的降血壓效果。因此，可以將此活性肽及其衍生物或者其鹽類作為高血壓患者的長期治療藥物，或者作為食品添加劑制成保健食品。文檔編號C07K14/435GK101210047SQ20061015582公開日2008年7月2日申請日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者杜昱光,王佳培,白雪芳,胡建恩申請人:中國科學院大連化學物理研究所