專利名稱:副溶血性弧菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。特別涉及對副溶血 性弧菌特定基因片段具有特異性的引物及引物組；還涉及將所述引物及引物組用環(huán)介導等 溫擴增法檢測副溶血性弧菌的檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
食源性疾病發(fā)病率較高，由沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌，霍亂 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，輪狀病毒以及諾如病毒引起的食物中毒，其發(fā)病 率在我國食源性疾病發(fā)病率中占非常高的比例，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。
目前對食源性病原體的檢測主要依靠病原體分離法、免疫學方法和各種PCR方 法。病原體分離雖然是金標準，但繁瑣費時，一般需要5天時間，最長需要一個月時間，而且 免疫學方法的特異性和敏感性均較低。
隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應用于細菌的診斷。例如PCR中 國專利公開號CN1M6825的專利申請，批露了一種利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特異性， 通過DNA提取、PCR擴增、電泳觀察等分子生物學手段檢測副溶血性弧菌的方法。雖然該方 法敏感、準確、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技 術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應用。
環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)(國際 專利公開號WO 00/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出一種核酸擴增新技術(shù)，即針對靶基因 的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物(如有需要還可以添加有環(huán)引物對)，利用一種鏈置換DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴增反應， 擴增結(jié)果可直接對擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進行判斷或者對其濁度進行檢測，也 可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料STOR Green I染色，通過肉眼進行判定。用于LAMP技術(shù)擴 增的2對引物乃針對基因6個區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時也具備不需要熱循 環(huán)、其單位時間內(nèi)擴增效率更高、且不需特殊儀器等優(yōu)點。但是目前未有利用環(huán)介導等溫擴 增法檢測副溶血性弧菌的檢測試劑盒，以及對副溶血性弧菌tih特定基因片段具有特異性 的引物及引物組的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種對副溶血性弧菌特定基因片段具有特異性的引 物。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種副溶血性弧菌檢測用引物，其特征在于，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述 靶基因為副溶血性弧菌的tih-—GenBank登陸號AY578148，所述引物與所述靶基因的946 位一1140位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。[0009]本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種對副溶血性弧菌特定基因片段具有特異性的 引物組。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成
正向外引物F3-tih GGCACAAGCGATGTACTACA
反向外引物B3-tih GACGCTGCACACTCAGAG
正向內(nèi)引物FIP-tih
GCGCAGAAGTTAGCGTCTCGAAGCGCAAGGTTACAACATCAC
反向內(nèi)引物BIP-tih GGTTTCGTGAACGCGAGCGACGCAATGCGTGGGTGTAC
可以擴增副溶血性弧菌的tih(AY578148)基因序列的946位-—1140位的核酸序 列的一部分或其互補鏈。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物組基于環(huán)介導等溫擴增法檢測 副溶血性弧菌的檢測方法。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種副溶血性弧菌的檢測方法，該方法用于檢測標本中是否存在副溶血性弧菌， 其特征在于，以副溶血性弧菌的tih基因序列的946位一1140位的核酸序列的一部分或 其互補鏈為靶，通過LAMP法用上述引物組選擇性擴增上述靶區(qū)域，確認是否存在有擴增產(chǎn) 物。
具體檢測方法為
1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標本；細菌待 檢標本用相應腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄 其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul 上清液做待檢模板DNA;
2)副溶血性弧菌的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)
取擴增反應液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul IOOul的反應體系，混勻點離后在約60-65°C條件下恒溫保溫約60-90分鐘，然后置于80°C 的環(huán)境下2分鐘滅活酶。
反應體系為(反應總體積20ul IOOul)
權(quán)利要求
1.一種副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成正向外引物 F3-tih GGCACAAGCGATGTACTACA反向外引物 B3-tih GACGCTGCACACTCAGAG正向內(nèi)引物FIP-tihGCGCAGAAGTTAGCGTCTCGAAGCGCAAGGTTACAACATCAC反向內(nèi)引物 BIP-tih GGTTTCGTGAACGCGAGCGACGCAATGCGTGGGTGTAC可以擴增副溶血性弧菌tih基因的特異性核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組擴增 副溶血性弧菌tih基因946位一1140位的特異核酸序列部分。
3.一種副溶血性弧菌的檢測方法，該方法用于檢測食品樣品中是否存在副溶血性弧 菌，其特征在于，以副溶血性弧菌GenBank登陸號為AY578148的tih基因946位-—1140 位的核酸序列為靶基因，通過LAMP法用權(quán)利要求
1-2任意一項所述的引物組選擇性擴增所 述靶基因，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的副溶血性弧菌檢測方法，其特征在于，具體檢測方法為1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品標本；細菌待檢標本用相應腸道增 菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA 提取試劑盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul上清液做待檢模板 DNA ；2)副溶血性弧菌的環(huán)介導等溫擴增取擴增反應液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul IOOul的反應體系，混勻點離后在約60-65°C條件下恒溫保溫約60-90分鐘，然后置于80°C 的環(huán)境下2分鐘滅活酶；反應總體積20ul IOOul的反應體系為成分終濃度或量待檢模板核酸模板I-IOuI正向內(nèi)引物FIP-tih1.0-2.0 uM擴反向內(nèi)引物BIP-tih1.0-2.0 uM增正向外引物F3-tih0.15-0.3 uM反反向外引物B3-tih0.15-0.3 uM應甜菜堿betaine0.8-1.5 M液dNTP1.0-1.6mMMgs042-6 mM反應緩沖液 Bst DNAPolvmerase Buffer IOx1/10反應體積ul酶Bst DNA Polymerase0.16-0.64U/ul雙蒸水ddH20加至預定反應體積ul其中IOXBst DNA Polymerase Buffer反應緩沖液含有200mM pH 8. 8的三羥基甲硫 氨酸甲烷-鹽酸、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；所述酶為每微升含8-16個活性單位的Bst DNA酶； 3) LAMP反應產(chǎn)物的檢測A)肉眼檢測與陰性對照管比較顯示，檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；或，B)加染料后檢測每25ul體系的反應管加1000XSTORGreen I invitrogenl_2ul， 1-5分鐘觀察結(jié)果，反應液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性；或，C)電泳檢測2-3%瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征性梯 狀條帶，最小片段在160bp左右，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶則結(jié)果為陰性。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的副溶血性弧菌檢測方法，其特征在于，當反應總體積為25ul 時，所述反應體系具體為
6. 一種副溶血性弧菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有權(quán)利要求
1所述的引物組的擴增反應液、酶； 所述擴增反應液中包括如下試劑
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的副溶血性弧菌檢測用試劑盒，其特征在于，擴增反應液包含1/10預定反應體積IOXBst DNA Polymerase Buffer反應緩沖液、 3. 6mM硫酸鎂、1. 6uM正向內(nèi)引物FIP-tih、l. 6uM反向內(nèi)引物BIP_tih、0. 2uM的正向外引物 F3-tih、0. 2uM 的反向外引物 B3-tih、l. 4mM dNTP 和 IM 甜菜堿；所述酶為每微升含8個活性單位、終濃度0. 32U/ul的Bst DNA酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6或7所述的副溶血性弧菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 還包括陰性及陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水；所述陽性對照模板為1 IOOnM 副溶血性弧菌基因組DNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。一種副溶血性弧菌檢測用引物，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因為副溶血性弧菌的tih---GenBank登陸號AY578148，所述引物與所述靶基因的946位---1140位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。本發(fā)明通過提供一種對副溶血性弧菌特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測標本中是否存在副溶血性弧菌特定基因片段，進而確定標本中是否存在副溶血性弧菌。
文檔編號C12Q1/04GKCN101153330 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200710030441
公開日2011年7月13日 申請日期2007年9月21日
發(fā)明者張麗榮, 張彩虹, 譚愛軍, 魏泉德 申請人:珠海市疾病預防控制中心導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),