專利名稱：哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)dna疫苗的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的疫苗及其制備技術(shù)，涉及基因工程及免疫學(xué)。具體地 說是哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)均為 革蘭氏陰性菌，廣泛分布于近岸海水環(huán)境，能感染海水魚類、對(duì)蝦、甲殼類等多種水產(chǎn)動(dòng)物， 是世界許多國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)殖對(duì)蝦和魚類的主要致病菌，每年都給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì) 損失。同時(shí)這兩種菌也是夏、秋季沿海地區(qū)海產(chǎn)品食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌。哈 維氏弧菌(Vibrio harveyi)的主要致病因子是寡肽結(jié)合蛋白、溶血素、胞外蛋白酶，副溶血 性弧菌的主要致病因子是溶血素、絲氨酸蛋白酶等。目前已制備的哈維氏弧菌和/或副溶血弧菌疫苗，主要有全菌滅活疫苗和重組蛋 白疫苗。滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全，但其缺點(diǎn)是免疫效果較差。重組蛋白疫苗由于制備過程 中涉及蛋白質(zhì)提取純化等步驟而造價(jià)昂貴。研究表明，DNA疫苗是一種在重組蛋白疫苗后興起的新型疫苗，其原理是將疫苗抗 原基因克隆于一真核表達(dá)載體中，隨后將該重組載體導(dǎo)入所要免疫的動(dòng)物體內(nèi)。疫苗抗原 蛋白在動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)可以持續(xù)表達(dá)合成，從而刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，達(dá)到免疫保護(hù)目的。因 此，DNA疫苗具有滅活疫苗和重組蛋白疫苗兩者的優(yōu)點(diǎn)。但是，現(xiàn)有的普通DNA疫苗仍存細(xì) 胞毒性、免疫保護(hù)率低等不利因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗的制備方法及 應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的二聯(lián)DNA疫苗的原理是將針對(duì)兩個(gè)細(xì)菌的兩個(gè)重要致病因子的功能區(qū) 域或亞單位蛋白基因融合克隆于同一真核表達(dá)載體中，從而實(shí)現(xiàn)針對(duì)兩種細(xì)菌的抗原融合 蛋白的表達(dá)。將這種二聯(lián)DNA疫苗導(dǎo)入所要免疫的動(dòng)物體內(nèi)，就會(huì)產(chǎn)生針對(duì)兩種細(xì)菌的融 合蛋白抗體，其免疫效果優(yōu)于普通DNA疫苗及兩種DNA疫苗的聯(lián)合免疫，且更加安全、方便、 有效。本發(fā)明即是采用這種技術(shù)，將哈維氏弧菌和副溶血弧菌的兩個(gè)主要致病因子的亞單 位蛋白基因融合構(gòu)建于真核表達(dá)載體中，制備成二聯(lián)DNA疫苗，從而達(dá)到雙重抵抗哈維氏 弧菌和副溶血弧菌對(duì)水產(chǎn)魚類侵染的目的?！N哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗，其特征在于所述的疫苗為副溶 血弧菌溶血素亞單位基因tdh2，和哈維氏弧菌寡肽結(jié)合蛋白基因oppA，通過6個(gè)核苷酸 GAATTC相連而成的tdh2-oppA融合基因真核表達(dá)工程載體疫苗，其中tdh2-oppA融合基因 的 DNA 序列為ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAA ACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATAC AACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATT AATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCA AGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGT ATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGT ATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAGTTTT ACGCATGTACAAGAATAAAATCACCAAAGCCCTTCTTCTAGGTGCTGGTCTGGCAGTGGCTGCCTCTTCTACTACTA CCGCTTTCGCTGCTGACGTTCCGGCAGGCATTAAACTAGCTGAAAAACAAGAAATCGTTCGTGGTAACGGAACTGAA GTGGCTACGATTGATCCACATAAGTCGTCTGGAGTACCTGAATCTCATGTGATTCGCGACCTTCTTGAAGGCCTTGT TAACCAAGACGGTGATGGCAATACAATTCCTGGTGTAGCAGAGAGTTGGGAGACAACAGATAACCAGACATTTACTT TTCATTTACGCAAAGATGCAAAGTGGTCTAACGGCGATCCTGTAACAGCACAAGATTTTGTATACAGTTGGCAGCGC TTTGTCGATCCTGCTACAGCCTCTCCATATGCTTGGTACATGGAGTTTACCAAGATGGTCAATGCTAAAGAAATTAT TGAAGGTAAAAAAGAAAAAAGTACTCTGGGTGTTAAGGCGGTAGATGCGCACACACTAGTTGTTGAACTTGAAACTG CTGTGCCTTATTTGTGATGATGGTAGGTCACACTTCAATGAAGCCAGTTCACAAGGCGACGATCGAGAAATACGGTG ATCAATGGACTAAGCCTTGGTCATTTTGTTGGTAACGGTGCTTACGAACTTGATAAGTGGGTCGTAAACGAGCGTAT GGTTCTGAAGCGCAACGTGCAGTACTGGGATAACGACAAGTCTGTGATTGATAAAGTAACGTTCCTTCCGATAGAAA ATCAAAATGCGGAAATGAATCGCTTTTTGTCTGGCGAGATTGACTTCACAGATGATTTGCCGATTGAACACTTTAAG CGCATGCAAAAAGAGCACCCAGAAGATCTGTCCGTTGTTGGCAGTCTGTGTAGTTATTACTACATATTTAACACTAA GAAAAAGCCGTTTAACGACTCTCGTGTTCGCAAAGCAATTTCTTATGCGATTGATCGTGATATCGTAGCGAATGCTA TTATGGGACAAGGACAAAAGCCAGCGTATTTCTTAACACCTGAGATAACAGCCGGCTTTGATCCTGAATTGCCAGCA TATGGTAGGATGACGCAAAAAGAGCGCAACGCAGAAGCCTCCCGACTGCTAGCCGAAGCAGGATATGGTAAAGATAA TCCCTTAGAGTTTACATTCCTGTATAACACAGATGAAAACCACAAAAAACTTGCCGTCGCACTTGGCTCCATGTGGA AAAAGACATTAGGCTTGAAAGTTACTCTAGAAAACCAAGAGTGGAAAACGTACTTATCTTCTACGAAGACTGGTGAT TTTGAGGTAGCCCGTGCGGGATGGTGTGGCGATTACAATGAAGCTTCCACATTTTTGACACTGATGACAAGTGACAA TACGAGCGCTGGTCAGCACTGGGGTAATAATGATTACGATATACTGATCGATAATGCCTTCCACTCAACTTCAGAAG AAGAGCGCACTAAGTTTTATTTAGACGCTGAAAAACTAATGGCAAAAGAAATGCCAATTGCTCCAATTTATCAATAC GTGAAGACTCGTTTACTTAACCCTCACGTTGGTGGCTTCCCTTCCAATAATGCGCAAGAAATGATCTACACCAAAGA TCTTTACATCAAAGCAGACTAA。本發(fā)明的哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗的制備方法即具體步驟如下(1)分別制備副溶血弧菌的溶血素亞單位基因tdh2和哈維氏弧菌的寡肽結(jié)合蛋 白基因oppA ；(2)再用DNA連接酶分別將基因tdh2和基因oppA克隆到載體pMD19_T Simple 中；(3)再通過內(nèi)切酶雙酶切技術(shù)，依次將基因tdh2和基因oppA克隆到同一個(gè)真核表 達(dá)載體pEGFP-Nl中，得到所要求的載有tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體；(4)用常規(guī)的方法擴(kuò)增培養(yǎng)并收獲上述tdh2-oppA融合基因真核表達(dá)工程載體， 并制成哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗懸液。一、上述制備基因tdh2和基因oppA的制備方法1、以副溶血弧菌DNA為模板，用引物a進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有XhoI和EcoRI雙 酶切位點(diǎn)的基因tdh2 ；引物a為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下
5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5’ CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3’2、以哈維氏弧菌DNA為模板，用引物b進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有EcoRI和BamHI雙 酶切位點(diǎn)的基因oppA ；引物b為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下5’ CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3’ ；二、克隆基因tdh2和基因oppA 1、將線性載體pMD19-T Simple與含有XhoI和EcoRI雙酶切位點(diǎn)的基因tdh2混 合，加入DNA連接酶進(jìn)行重組連接，得到載體pMD19-T Simple-tdh2 ；2、將線性載體pMD19-T Simple與含有EcoRI和BamHI雙酶切位點(diǎn)的基因oppA混 合，加入DNA連接酶進(jìn)行重組連接，得到載體pMD19-T Simple-OppA0三、構(gòu)建tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體1、將真核表達(dá)載體pEGFP-Nl用XhoI和EcoRI雙酶切，分離后得到線性載體 pEGFP-Nl ；2、將載體pMD19-T Simple_tdh2用XhoI和EcoRI雙酶切，分離后得到基因tdh2 ；3、將線性載體pEGFP-Nl與基因tdh2混合，加入DNA連接酶進(jìn)行重組連接，得到 tdh2基因的真核表達(dá)工程載體pEGFP-Nl-tdh2 ；4、將上述真核表達(dá)載體pEGFP-Nl_tdh2用EcoRI和BamHI雙酶切，分離后得到線 性的載體 pEGFP-Nl-tdh2 ；5、將載體pMD19-T Simple-oppA用EcoRI和BamHI雙酶切，分離后得到基因oppA ；6、將線性載體pEGFP-Nl_tdh2與基因oppA混合，加入DNA連接酶進(jìn)行重組連接， 得到載有tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體pEGFP-Nl-tdh2-oppA。四、哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA亞單位疫苗懸液的制備1、將上述所得的tdh2-oppA融合基因真核表達(dá)工程載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci 中，進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增培養(yǎng)，提取得到載有tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體，將該載體 溶于0. 05 0. 20mol/L磷酸鹽緩沖液PBS中至濃度為200 μ g/ml,即得到哈維氏弧菌和副 溶血弧菌二聯(lián)疫苗懸液。2、按常規(guī)免疫方法，以100 μ 1/尾的劑量對(duì)魚類進(jìn)行免疫。本發(fā)明的哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗應(yīng)用于魚類免疫。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本疫苗制備方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)，重復(fù)率高；融合基因真核表達(dá)構(gòu)建的效 率聞；2、使用兩種致病菌的致病因子蛋白亞單位基因構(gòu)建本二聯(lián)DNA疫苗，專一性更 強(qiáng)，且避免了產(chǎn)生細(xì)胞毒性的不利因素；3、本二聯(lián)DNA疫苗雙基因融合蛋白表達(dá)，雙重免疫保護(hù)；應(yīng)用于魚類的免疫效果 較滅活疫苗、重組蛋白疫苗及一價(jià)DNA疫苗高；免疫保護(hù)率高于其他類型的疫苗；且只需一 次免疫操作即可使魚類獲得對(duì)哈維氏弧菌和副溶血弧菌的免疫力；4、哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗使用時(shí)不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。


圖1 :tdh2-oppA融合基因PCR結(jié)果電泳圖。其中，Ml核酸 DL2000Marker ；M2 核酸 DL15000Marker ；1:陰性對(duì)照；2 用引物a進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的基因tdh2 ；3 用引物b進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的基因oppA ；4 融合基因 tdh2_oppA圖2 :ttdh2-oppA融合基因蛋白表達(dá)電泳圖。其中，M 蛋白 Marker ；1 基因tdh2單獨(dú)表達(dá)的結(jié)果；2 基因oppA單獨(dú)表達(dá)的結(jié)果3 :tdh2-oppA融合基因的表達(dá)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在舉例描述，而非以任何 形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法進(jìn)行，如 J. Sambrook et al :Molecular Cloning :ALaboratory manual(New York :CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按制造廠商建議的條件。所用載體與試 劑皆可從相關(guān)廠商購(gòu)得。實(shí)施例1 制備tdh2_oppA融合基因一、制備基因tdh2和基因oppA 1.制備基因 tdh2 (1)根據(jù)GeneBank中所收錄的副溶血弧菌的熱穩(wěn)定溶血素亞單位基因tdh2的序 列，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增基因tdh2的引物a，其序列為5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5' CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3'(2)以副溶血弧菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到570bp的PCR產(chǎn)物；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性1分鐘，58°C退火1分鐘，72°C延伸1分 鐘；如此反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)體系為:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0. 5 μ 1的引物a，然后用滅菌去離子水補(bǔ)足到50 μ 1 ；(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有570bp的目的片段的凝膠切 下，回收純化后得到含有XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)的基因tdh2。2.制備基因 oppA (1)根據(jù)GeneBank中所收錄的的哈維氏弧菌的寡肽結(jié)合蛋白基因oppA的序列，設(shè) 計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增基因oppA的引物b，其序列為5’ CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3’
(2)以哈維氏弧菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到1665bp的PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件為94 V預(yù)變性5分鐘；94 V變性1分鐘，61°C退火1分鐘，72 °C延伸2分 鐘；如此反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)體系為:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0.5μ 1的引物b，然后用滅菌去離子水補(bǔ)足到50 μ 1。(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有1665bp目的片段的凝膠切 下，回收純化后得到含有EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)的基因oppA。二、克隆基因 tdh2 和 oppA 1.克隆基因 tdh2:(1)取0. 5 μ 1的線性載體pMD19-T Simple，加入4. 5 μ 1純化的基因tdh2，混合， 再加入5 μ IDNA連接酶，于16°C連接反應(yīng)16小時(shí)，得到基因tdh2連接產(chǎn)物；(2)將基因tdh2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌DH5ci中，并于含有氨芐青霉 素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12小時(shí)；(3)培養(yǎng)后利用常規(guī)的藍(lán)白斑篩選方法，挑選白斑接入含氨芐青霉素的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，提取基因tdh2載體DNA ；(4)以提取的基因tdh2載體DNA為模板，以引物a進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)，并且用XhoI 和EcoRI對(duì)基因tdh2載體進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，篩選得到含有工程載體pMD 19-T Simple-tdh2 的陽(yáng)性菌株，并測(cè)序確定。2.克隆基因 oppA (1)取0. 5μ 1的載體pMD19_TSimple，加入4· 5μ 1純化的基因ορρΑ，混合，再加入 5μ 1 DNA連接酶，于16°C連接反應(yīng)16小時(shí)，得到基因oppA連接產(chǎn)物。(2)將上述基因oppA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌DH5ci中，并于含有氨芐 青霉素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12小時(shí)。(3)培養(yǎng)后利用藍(lán)白斑篩選的方法，挑選白斑接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，提取基因oppA載體DNA。(4)依提出的上述基因oppA載體DNA為模板，以引物b進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)，并且 用EcoRI和BamHI對(duì)基因oppA載體進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，篩選得到含有工程載體pMD 19-T Simple-oppA的陽(yáng)性菌株，并測(cè)序確定。實(shí)施例2 構(gòu)建tdh2_oppA融合基因真核表達(dá)載體pEGFP-Nl-tdh2_oppA 1.按實(shí)施例1的方法制備帶有XhoI和EcoRI雙酶切位點(diǎn)的基因tdh2載體DNA ；2.將真核表達(dá)載體pEGFP-Nl和基因tdh2載體DNA用XhoI、EcoRI雙酶切，分離 后得到線性載體pEGFP-Nl和線性基因tdh2 ；3.取4. 5 μ 1線性基因tdh2，加入0. 5 μ 1線性載體pEGFP-Nl，混合，再加入5 μ 1 DNA連接酶，16°C連接反應(yīng)16小時(shí)，得到基因tdh2連接產(chǎn)物；4.將基因tdh2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci中培養(yǎng)，挑取菌落培養(yǎng)后提取載體 DNA,經(jīng)PCR反應(yīng)和Xhol、EcoRI雙酶切檢測(cè)后，篩選得到工程載體pEGFP-Nl_tdh2 ；5.按實(shí)例1的方法制備帶有EcoRI和BamHI雙酶切位點(diǎn)的基因oppA載體DNA ；6.將真核表達(dá)工程載體pEGFP-Nl_tdh2和基因oppA載體DNA用EcoRI和BamHI 雙酶切，得到線性的工程載體pEGFP-Nl-tdh2和線性基因oppA ；
7.取4. 5 μ 1線性基因ορρΑ，加入0. 5 μ 1線性載體pEGFP-Nl_tdh2，混合，再加入 5 μ 1 DNA連接酶，16°C連接反應(yīng)16小時(shí)，得到pEGFP-Nl-tdh2-oppA連接產(chǎn)物；8.將融合基因tdh2-oppA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中培養(yǎng)，挑取菌落培養(yǎng) 后提取載體DNA，經(jīng)PCR反應(yīng)和Xhol、BamHI雙酶切檢測(cè)后，篩選得到融合基因真核表達(dá)工 程載體 pEGFP-m-tdh2-oppA。9.為了驗(yàn)證構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP-Nl-tdh2-oppA中同時(shí)包含基因tdh2和基 因oppA，將含有上述真和表達(dá)的菌株接入到0. 6%卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩 培養(yǎng)12小時(shí)后提取載體DNA，并經(jīng)PCR和雙酶切檢測(cè)，用pEGFP-N-5’和pEGFP_N_3’這對(duì)引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序后，證明融合基因序列片段插入位置正確，且不存在移碼突變和提 前終止。PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。10.為了驗(yàn)證tdh2-oppA融合基因的蛋白能正常表達(dá)，分別將基因tdh2、基因oppA 和融合基因tdh2-oppA序列片段連接到原核表達(dá)載體pET28a中，再轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌 BL21中，通過異丙基硫代半乳糖苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，得到了與預(yù)想 的分子量大小相同的目的蛋白，證明這些蛋白都能正常表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3 二聯(lián)DNA亞單位疫苗懸液的制備和使用將上述實(shí)施例2所得的pEGFP-Nl-tdh2-oppA工程載體轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌DH5ci中，在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-18小時(shí)后，提取工程載體 pEGFP-Nl-tdh2-oppA，對(duì)該載體進(jìn)行去除內(nèi)毒素處理后，將載體溶于0. 05mol/L磷酸鹽緩 沖液PBS中至濃度為200 μ g/ml,即得到哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA亞單位疫苗懸液。上述疫苗懸液可直接對(duì)魚類進(jìn)行免疫。以養(yǎng)殖的牙鲆為例進(jìn)行免疫方法如下免 疫實(shí)驗(yàn)前兩周購(gòu)買同一批次的健康牙鲆，室溫飼養(yǎng)于水箱中，通氣并正常換水、投餌；用制 備的工程載體pEGFP-Nl-tdh2-oppA對(duì)實(shí)驗(yàn)牙鲆進(jìn)行肌肉注射免疫，注射部位為靠近背鰭 的肌肉較為厚實(shí)的地方，注射劑量為100μ 1/尾。同時(shí)設(shè)置注射等量滅菌磷酸鹽緩沖液PBS 的對(duì)照組。接種后不同時(shí)間尾靜脈取血，制備血清用于抗體檢測(cè)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)牙鲆免疫接種4 5周后，用哈維氏弧菌和副溶血弧菌對(duì)其進(jìn)行肌肉注射攻毒，攻毒后觀察并記錄實(shí)驗(yàn)牙鲆的 死亡情況，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率RPS為75%。
權(quán)利要求
一種哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗，其特征在于在真核表達(dá)載體上連接入副溶血弧菌溶血素亞單位基因tdh2和哈維氏弧菌寡肽結(jié)合蛋白基因oppA通過6個(gè)核苷酸GAATTC相連而成的tdh2-oppA融合基因，其中tdh2-oppA融合基因的DNA序列為ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAGTTTTACGCATGTACAAGAATAAAATCACCAAAGCCCTTCTTCTAGGTGCTGGTCTGGCAGTGGCTGCCTCTTCTACTACTACCGCTTTCGCTGCTGACGTTCCGGCAGGCATTAAACTAGCTGAAAAACAAGAAATCGTTCGTGGTAACGGAACTGAAGTGGCTACGATTGATCCACATAAGTCGTCTGGAGTACCTGAATCTCATGTGATTCGCGACCTTCTTGAAGGCCTTGTTAACCAAGACGGTGATGGCAATACAATTCCTGGTGTAGCAGAGAGTTGGGAGACAACAGATAACCAGACATTTACTTTTCATTTACGCAAAGATGCAAAGTGGTCTAACGGCGATCCTGTAACAGCACAAGATTTTGTATACAGTTGGCAGCGCTTTGTCGATCCTGCTACAGCCTCTCCATATGCTTGGTACATGGAGTTTACCAAGATGGTCAATGCTAAAGAAATTATTGAAGGTAAAAAAGAAAAAAGTACTCTGGGTGTTAAGGCGGTAGATGCGCACACACTAGTTGTTGAACTTGAAACTGCTGTGCCTTATTTTGTGATGATGGTAGGTCACACTTCAATGAAGCCAGTTCACAAGGCGACGATCGAGAAATACGGTGATCAATGGACTAAGCCTGGTCATTTTGTTGGTAACGGTGCTTACGAACTTGATAAGTGGGTCGTAAACGAGCGTATGGTTCTGAAGCGCAACGTGCAGTACTGGGATAACGACAAGTCTGTGATTGATAAAGTAACGTTCCTTCCGATAGAAAATCAAAATGCGGAAATGAATCGCTTTTTGTCTGGCGAGATTGACTTCACAGATGATTTGCCGATTGAACACTTTAAGCGCATGCAAAAAGAGCACCCAGAAGATCTGTCCGTTGTTGGCAGTCTGTGTAGTTATTACTACATATTTAACACTAAGAAAAAGCCGTTTAACGACTCTCGTGTTCGCAAAGCAATTTCTTATGCGATTGATCGTGATATCGTAGCGAATGCTATTATGGGACAAGGACAAAAGCCAGCGTATTTCTTAACACCTGAGATAACAGCCGGCTTTGATCCTGAATTGCCAGCATATGGTAGGATGACGCAAAAAGAGCGCAACGCAGAAGCCTCCCGACTGCTAGCCGAAGCAGGATATGGTAAAGATAATCCCTTAGAGTTTACATTCCTGTATAACACAGATGAAAACCACAAAAAACTTGCCGTCGCACTTGGCTCCATGTGGAAAAAGACATTAGGCTTGAAAGTTACTCTAGAAAACCAAGAGTGGAAAACGTACTTATCTTCTACGAAGACTGGTGATTTTGAGGTAGCCCGTGCGGGATGGTGTGGCGATTACAATGAAGCTTCCACATTTTTGACACTGATGACAAGTGACAATACGAGCGCTGGTCAGCACTGGGGTAATAATGATTACGATATACTGATCGATAATGCCTTCCACTCAACTTCAGAAGAAGAGCGCACTAAGTTTTATTTAGACGCTGAAAAACTAATGGCAAAAGAAATGCCAATTGCTCCAATTTATCAATACGTGAAGACTCGTTTACTTAACCCTCACGTTGGTGGCTTCCCTTCCAATAATGCGCAAGAAATGATCTACACCAAAGATCTTTACATCAAAGCAGACTAA。
2.哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗的制備方法，其特征在于(1)分別制備副溶血弧菌的溶血素亞單位基因tdh2和哈維氏弧菌的寡肽結(jié)合蛋白基 因 oppA ；(2)用DNA連接酶分別將基因tdh2和基因oppA克隆到載體pMD19_TSimple中，獲得 載體 pMD19-T Simple-tdh2 和 pMD19_T Simple-oppA ；(3)利用DNA內(nèi)切酶雙酶切技術(shù)分別使pMD19-TSimple_tdh2和pMD19-TSimple_oppA獲得粘性末端，再依次將具有粘性末端的基因tdh2和基因oppA克隆到同一個(gè)真核表達(dá)載 體pEGFP-Nl中，得到載有tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體；(4)擴(kuò)增培養(yǎng)并收獲上述tdh2-oppA融合基因真核表達(dá)工程載體，并制成哈維氏弧菌 和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗懸液。
3.如權(quán)利要求2所述的哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗的制備方法，其特征在 于上述tdh2-oppA融合基因真核表達(dá)工程載體的構(gòu)建方法如下(1)制備基因tdh2和基因oppA以副溶血弧菌DNA為模板，用引物a進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有BamHI和EcoRI雙酶切位 點(diǎn)的基因tdh2 ；其引物a序列如下5' CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3' 5’ CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3’ ；以哈維氏弧菌DNA為模板，用引物b進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有EcoRI和XhoI雙酶切位 點(diǎn)的基因oppA ；其引物b序列如下5' CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3' 5' CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3'；(2)克隆基因tdh2和基因oppA將線性載體PMD19-T Simple與含有XhoI和EcoRI雙酶切位點(diǎn)的基因tdh2混合，加入 DNA連接酶進(jìn)行重組連接，得到載體pMD19-T Simple-tdh2 ；將線性載體PMD19-T Simple與含有EcoRI和BamHI雙酶切位點(diǎn)的基因oppA混合，加 入DNA連接酶進(jìn)行重組連接，得到載體pMD19-T Simple-oppA ；(3)構(gòu)建tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體將真核表達(dá)載體pEGFP-m和pMD19-T Simple_tdh2分別用XhoI和EcoRI雙酶切，分 離后得到線性載體pEGFP-Nl和線性基因tdh2，再將線性載體pEGFP-Nl和基因tdh2混合， 加入DNA連接酶進(jìn)行重組連接，得到工程載體pEGFP-Nl-tdh2 ；將工程載體pEGFP-Nl-tdh2和pMD19_T Simple-oppA分別用EcoRI和BamH雙酶切，分 離后得到線性載體pEGFP-Nl-tdh2和基因oppA，再將線性載體pEGFP-Nl_tdh2和基因oppA 混合，加入DNA連接酶進(jìn)行重組連接，得到載有tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體 pEGFP-Nl-tdh2-oppA0
4.如權(quán)利要求2所述的哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗的制備方法，其特征在 于上述步驟(4)中的二聯(lián)DNA疫苗懸液的制備方法如下將載有tdh2-oppA融合基因真核表達(dá)工程載體pEGFP-Nl-tdh2-oppA轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌DH5ci中，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取得到載有tdh2-oppA融合基因的真核表達(dá)工程載體 pEGFP-Nl-tdh2-oppA,將載體溶于0. 05 0. 20mol/L磷酸鹽緩沖液PBS中至濃度為 200 μ g/ml，制成哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗懸液。
5.哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗懸液以50 200μ 1/尾的劑量應(yīng)用于魚類 免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗的制備方法和應(yīng)用，其特征是將哈維氏弧菌oppA基因和副溶血弧菌tdh2基因通過6個(gè)核苷酸GAATTC相連成的tdh2-oppA融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體疫苗；其制備方法包括使基因tdh2和oppA克隆到線性載體pMD19-T Simple中；再通過雙酶切技術(shù)，將該融合基因插入到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中構(gòu)建得到pEGFP-N1-tdh2-oppA融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體疫苗；最后用常規(guī)的方法制成哈維氏弧菌和副溶血弧菌二聯(lián)DNA疫苗懸液，以100μl/尾的劑量對(duì)魚類進(jìn)行免疫。本發(fā)明操作性強(qiáng)重復(fù)率高，安全無毒副作用，可對(duì)魚類雙重免疫保護(hù)，免疫效果較滅活疫苗、重組蛋白疫苗及普通DNA疫苗高。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101879317SQ201010186539
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者何慶芳, 劉瑞, 徐廣峰, 陳吉祥 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)