一種食品中副溶血弧菌的檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測領域，具體涉及一種食品中副溶血弧菌的檢測試劑盒及檢測 方法。
【背景技術】
[0002] 副溶血弧菌是一種革蘭陰性多形態(tài)桿菌，在自然界中分布廣泛，海產品如海哲、黃 泥螺及蟹類等其攜帶率最高，此外蛋類、新鮮蔬果及肉制品中也較常見。當人們直接或間接 食用含有該菌的食物后，可引起腸道疾病，如腹瀉、胃腸炎，此外，還可引起其他系統疾病， 如關節(jié)炎及必臟疾病。副溶血弧菌是目前細菌性食物中毒中最主要的病原菌，給人類健康 造成極大的危脅，對水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損傷。
[0003] 副溶血弧菌傳統的鑒定與檢測方法包括鏡檢、生化鑒定、嗜鹽性試驗、免疫色譜法 及DNA雜交法等，但均存在各自不足之處，如鏡檢、生化鑒定、嗜鹽性試驗操作復雜、檢測時 間長，且靈敏度低，而免疫色譜法及DNA雜交法對設備要求高，而檢測過程易受污染物影 響。本發(fā)明提供一種英光定量PCR檢測方法，對食品中副溶血弧菌進行檢測時，特異性強、 敏感性高，操作簡便，檢測迅速，可避免常規(guī)PCR檢測方法產生的一系列問題，

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明針對上述現在技術的缺陷，提供一種操作簡便、準確率高、檢測成本低、無 污染、假陽性率低的檢測試劑盒及檢測方法。
[0005] -種食品中副溶血弧菌英光定量PCR檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括培養(yǎng)基及 檢測液，所述的培養(yǎng)基為含有2%氯化鋼結晶紫增菌液的嗜鹽菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，所述的 檢測液由W下含量的組分制成：
[0006] 表爾活性荊 5-! 0ml 堿溶液 2-5ml
[0007] 酸溶液 2-5ml 傑護液 5-8ml DNA提取液 20-50uJ !〇X段旌緩沖液 ！-5訊} 疊鑛漠化之錠 BsiDNA聚合酶 5-lOul PC民引物 5-iOul
[000引優(yōu)選的，所述的表面活性劑選自吐溫20、吐溫40、甜菜堿中的一種或多種，所述的 表面活性劑濃度為5-lOmg/ml。
[0009] 優(yōu)選的，所述的堿溶液選自化OH、K0H中的一種或多種，濃度為1-1.8mg/ml，優(yōu)選 的，所述的化0H、K0H體積比為（2-6) : (3-5)，；所述的酸溶液選自肥L、肥S04中的一種或 多種，所述的肥U肥S04的體積比為（2-5) : (1-8)，濃度為2-3mg/ml。
[0010] 優(yōu)選的，所述的DM提取液為0. 5-0.8mmol/L的Tris-HCl。
[0011] 優(yōu)選的，所述的BstDM聚合酶濃度為0. 35-0. 4U/
[0012] 所述的 10X反應緩沖液為 20-50mlTris-肥 1、6-I0ml0. 2-0. 5mg/mlKC1、 6-10mll.8-3. 5mg/mlNH4S04、10-15ml2. 8-5. 5mg/mlΜ拆04 的混合液。
[001引所述的PCR引物由FAM標記5'，TRAMA標記3'，上游： 5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3 ;下游；5-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3 ;
[0014] 一種采用如上所述的檢測試劑盒對食品中副溶血弧菌進行檢測的方法，包括W下 步驟：
[0015] (1)細菌培養(yǎng)：在培養(yǎng)基中加入增菌液5-lOml，氯化鋼0. 5-2g，蛋白腺3-6g，固體 樣品取樣10-20mg，用均質器打碎，液體樣品取樣3-8ml，充分搖勻，對樣品進行預處理后， 置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-371：，培養(yǎng)時間為6-12h;并設已知無副溶血菌感染的食 品樣品為空白對照組；
[0016] (2)將步驟（1)中培養(yǎng)后的可疑菌落取出，加入無菌生理鹽水，并加入無菌酸試劑 或堿試劑，制成PH=8. 4-8.8的菌懸液；
[0017] (3)將步驟（2)中制得的菌懸液離必5-8min，棄上清，加入DNA提取液80-100ml， 加入疊氮漠化己錠10-20ml，混勻加熱，加熱溫度為90-95°C，加熱時間為5-lOmin，離必，棄 上清，得樣品待測液；
[001引 （4)將步驟（4)中制得的樣品待測液加入5-10至PCR管中，于63°C恒溫水浴箱內 進行恒溫擴增反應，反應時間為60-90min;
[0019] (5)在步驟（4)中的反應產物中加入SYBRGreenI英光染料，觀察顏色，陽性： 綠色，陰性：澄紅色；對陽性者進行英光定量PCR檢測，具體方法為；93°C預變性3min，55°C 變性30s，40個循環(huán)，Imin退火及延伸，讀英光值，英光激發(fā)波長為485-500nm，檢測波長為 525nm。
[0020] 本發(fā)明與現有技術相比，具有W下優(yōu)點：
[0021] 1.本發(fā)明整個操作過程均在密封單管內完成，避免了常規(guī)PCR檢測時擴增產物污 染，同時本發(fā)明還設立了空白對照組，使檢測結果更易判斷，提高了檢測結果的準確性。
[0022] 2.本發(fā)明所需儀器簡單，操作簡便，經常規(guī)PCR儀進行循環(huán)，經國產微量英光檢測 儀測英光值，經簡單計算即可得出檢測結果，在我國基層醫(yī)院及偏遠地區(qū)均可推廣使用，且 其特異性比傳統方法及常規(guī)PCR法明顯升高。
[0023] 3.本發(fā)明檢測前先將待測樣品置于特定培養(yǎng)基類進行細菌培養(yǎng)，可增加目的細 菌，減少PCR干擾物，明顯提高定性檢測低限，可達2c化/g，即明顯降低了假陽性與假陰性 率，同時，也明顯縮短培養(yǎng)時間，縮短檢測時間，在細菌培養(yǎng)后，加入酸或堿試劑調節(jié)PH，更 利于后續(xù)的DNA提取。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1
[0025] -種食品中副溶血弧菌英光定量PCR檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括培養(yǎng)基及 檢測液，所述的培養(yǎng)基為含有2%氯化鋼結晶紫增菌液的嗜鹽菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，所述的 檢測液由W下含量的組分制成：
[0026] 表爾活性菊 纖磯鐵這ml酸溶液 細重1 麵妒觀 縱? DNA提取液 20ul iOX反腐鑛沖液 1ml *鐵澳化己錠 校st：DNA聚合酶 5d PC民弓[物 茹1
[0027] 所述的表面活性劑為吐溫20,濃度為5mg/ml。
[0028] 所述的堿溶液為化0H，濃度為Img/ml ;所述的酸溶液為肥L濃度為2mg/ml。
[0029]所述的DNA提取液為 0. 5mmol/L的Tris-HCl。
[0030] 所述的BstDNA聚合酶濃度為0.35U/U1
[0031]所述的 10X反應緩沖液為 20mlTris-肥l、6ml0. 2mg/mlKCl、6mll.8mg/ml NH4S04、10ml2.8mg/mlM拆04 的混合液。
[003引所述的PCR引物由FAM標記5'，TRAMA標記3'，上游： 5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3;下游；5-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3;
[0033] 一種采用如上所述的檢測試劑盒對食品中副溶血弧菌進行檢測的方法，包括W下 步驟：
[0034] (1)細菌培養(yǎng)：在培養(yǎng)基中加入增菌液5ml，氯化鋼0. 5g，蛋白腺3g，固體樣品取樣 lOmg，用均質器打碎，液體樣品取樣3ml，充分搖勻，對樣品進行預處理后，置培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間為化；并設已知無副溶血菌感染的食品樣品為空白對照組；
[0035] (2)將步驟（1)中培養(yǎng)后的可疑菌落取出，加入無菌生理鹽水，并加入無菌酸試劑 或堿試劑，制成PH=8. 4的菌懸液；
[003引 做將步驟似中制得的菌懸液離必5-8min，棄上清，加入DNA提取液80ml，加入 疊氮漠化己錠10ml，混勻加熱，加熱溫度為9(TC，加熱時間為5min，離必，棄上清，得樣品待 測液；
[0037] (4)將步驟（4)中制得的樣品待測液加入5-10至PCR管中，于63°C恒溫水浴箱內 進行恒溫擴增反應，反應時間為60min;
[0038] (5)在步驟（4)中的反應產物中加入SYBRGreenI英光染料，觀察顏色，陽性：綠 色，陰性：澄紅色；對陽性者進行英光定量PCR檢測，具體方法為；93°C預變性3min，55°C變 性30s，40個循環(huán)，Imin退火及延伸，讀英光值，英光激發(fā)波長為485nm，檢測波長為525nm。[00測 實施例2
[0040] 一種食品中副溶血弧菌英光定量PCR檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括培養(yǎng)基及 檢測液，所述的培養(yǎng)基為含有2%氯化鋼結晶紫增菌液的嗜鹽菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，所述的 檢測液由W下含量的組分制成：
[0041] 表兩活性趙 10ml 繼癖繼： 細1 酸溶液 如il 保護液 8ml DNA提取液 洗ul 10X反應緩沖液 如li #鐵澳化乙錠 6m! 悅tONA.潔命酶 10i.ii PCR.巧l·物 lOiil
[0042] 所述的表面活性劑為甜菜堿，濃度為lOmg/ml。
[0043] 所述的堿溶液為K0H，濃度為1.8mg/ml;所述的酸溶液為肥S04中的一種或多種， 濃度為3mg/ml。
[0044]所述的DM提取液為 0.8mmol/L的Tris-HCl。
[0045] 所述的BstDNA聚合酶濃度為0.4U/
[0046]所述的 10X反應緩沖液為 50mlTris-肥lUOmlO. 5mg/mlKCl、10ml3. 5mg/ml NH4S04、15ml5. 5mg/mlM拆04 的混合液。
[0047]所述的PCR引物由FAM標記5'，TRAMA標記3'，上游： 5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3 ;下游；5-