本發(fā)明屬于干細(xì)胞誘導(dǎo)分化領(lǐng)域，具體涉及一種用于羊膜上皮干細(xì)胞多方向誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、胚胎在發(fā)育過程中形成胎膜，胎膜的最內(nèi)層為羊膜，羊膜由厚的基底膜和無血管基質(zhì)組成。電鏡下，羊膜從內(nèi)而外可分為5層：上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層。羊膜上皮細(xì)胞（human?amniotic?epithelial?cells，haecs）以單層敷著在羊膜表面上皮層，面向羊水，容易分離和培養(yǎng)，其是由胚胎第8天上胚層發(fā)育而來，先于胚胎三個胚層（外、中和內(nèi)三個胚層）形成，故而仍然保留胚胎干細(xì)胞主要特征的分子標(biāo)志物（例如oct-4、sox-2、nanog、ssea-3、ssea-4等）。由于haecs缺乏端粒酶，在體內(nèi)外都不會形成畸胎瘤，所以在臨床上移植是安全的；若要將它用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)入一個sox-2基因，培養(yǎng)7天之后就會形成ips克隆球，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)就會形成畸胎瘤。haecs的分化潛能甚至要優(yōu)于同樣存在于羊膜組織中的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞（human?amniotic?mesenchymal?cells，hamscs）。

2、haecs的干細(xì)胞具有如下特征：haecs幾乎表達(dá)所有胚胎干細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物，其中oct-4、sox-2和nanog三個基因的表達(dá)是維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性的必要條件；haecs具有多能干細(xì)胞的特征，在體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)條件下，haecs可以分化為內(nèi)胚層（胰腺、肝）細(xì)胞、外胚層（神經(jīng)）細(xì)胞和中胚層（心肌）細(xì)胞等；haecs還表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞（msc）樣表型，即符合三項中胚層譜系分化潛能（成骨、脂肪形成和軟骨形成）、cd90、cd105和cd73的細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志缺乏cd45、cd34、cd14、cd79和hla-dr的標(biāo)準(zhǔn)。

3、此外，haecs的干細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢，如不需要侵入性采集程序、倫理約束最小，來源易于獲得，無需擴(kuò)增也可以擁有較多的細(xì)胞數(shù)量，具有免疫抑制和調(diào)節(jié)作用，能遏制免疫排斥與炎癥反應(yīng)，能分泌多種細(xì)胞因子和生長營養(yǎng)因子，有助于細(xì)胞治療過程中宿主自身干細(xì)胞的修復(fù)，同時也不涉及與年齡或環(huán)境相關(guān)的dna損傷，具有遺傳穩(wěn)定性等，因此，haecs的干細(xì)胞被認(rèn)為是生物學(xué)研究和再生醫(yī)學(xué)中有前途的干細(xì)胞來源。由此，制備用于羊膜上皮干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基能有效促進(jìn)haecs干細(xì)胞在臨床及醫(yī)療科研方面的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于以上問題，本發(fā)明提供一種用于羊膜上皮干細(xì)胞多方向誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基，具體將羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞。其中培養(yǎng)基ⅰ中涉及干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅰ、植物源異鼠李素及少量肝細(xì)胞生長因子，干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅰ是由mirna-141及改性的殼聚糖制備而成；培養(yǎng)基ⅱ涉及干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅱ、植物源迷迭香酸、苔蘚抑素1及少量膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅱ是由mirna-206及改性的殼聚糖制備而成。本發(fā)明所獲用于羊膜上皮干細(xì)胞多方向誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化效果較好，可用性更高、毒性更低，且副作用更小，不具有大量使用重組生長因子而導(dǎo)致的毒性作用及潛在的排斥問題。

2、本發(fā)明提供一種用于羊膜上皮干細(xì)胞多方向誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基，涉及培養(yǎng)基ⅰ、培養(yǎng)基ⅱ；

3、其中，培養(yǎng)基ⅰ是一種用于羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)基，具體為dmdm/f12培養(yǎng)基中添加80-100μl/ml的干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅰ、10-15ng/ml植物源異鼠李素、1-2ng/ml肝細(xì)胞生長因子。

4、所述干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅰ的制備方法如下：

5、l1.采用化學(xué)合成的方式獲得mirna-141-3p，以凍干粉形式保存?zhèn)溆?，使用時采用滅菌的rnase-free?h2o配制獲得質(zhì)量體積濃度為70-80mg/l的mirna-141-3p溶液；

6、l2.將殼聚糖溶于乙酸溶液中，獲得質(zhì)量體積濃度為4-5mg/ml的殼聚糖溶液，將肉豆蔻酸溶于75%乙醇中，獲得質(zhì)量體積濃度為2-3mg/ml的肉豆蔻酸溶液，將edc.hcl加入到肉豆蔻酸溶液中，以180-220rpm的轉(zhuǎn)速攪拌30-40min，獲得溶液1，將溶液1滴入殼聚糖溶液中，室溫下保持24-30h，獲得溶液2，將溶液2采用去離子水透析28-32h，結(jié)束后真空冷凍干燥獲得物質(zhì)1；

7、l3.將步驟l2所獲物質(zhì)1溶于滅菌的rnase-free?h2o獲得質(zhì)量體積濃度為25-30mg/l的溶液3，將步驟l1所獲mirna-141-3p溶液與溶液3按照體積比1：1-1.4混合，以150-200w功率超聲處理2-4min，結(jié)束后加熱至30-40℃并保持15-20min，結(jié)束后立即冰水浴，即獲得干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑，保存于4℃環(huán)境備用。

8、較佳地，步驟l1中mirna-141-3p的序列為5’-uaacacugucugguaaagaugg-3’。

9、較佳地，步驟l2中殼聚糖為脫乙酰度≥95%、mw在5000-6000da范圍內(nèi)的產(chǎn)品，乙酸溶液的質(zhì)量百分比濃度優(yōu)選1%，edc.hcl的加入量為肉豆蔻酸溶液質(zhì)量的5-8%，溶液1：殼聚糖溶液的體積比為1：1-1.2，透析優(yōu)選截留分子量為3kda的透析袋。

10、所述植物源異鼠李素是從天然植物中提取獲得的異鼠李素，異鼠李素的純度≥95%，天然植物優(yōu)選沙棘或胡頹子。

11、其中，培養(yǎng)基ⅱ是一種用于羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的培養(yǎng)基，具體為dmdm/f12培養(yǎng)基中添加70-90μl/ml的干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅱ、1-3ng/ml苔蘚抑素1、8-10ng/ml植物源迷迭香酸、0.8-1ng/ml膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。

12、所述干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅱ的制備方法如下：

13、s1.采用化學(xué)合成的方式獲得mirna-206-3p，以凍干粉形式保存?zhèn)溆?，使用時采用滅菌的rnase-free?h2o配制獲得質(zhì)量體積濃度為70-80mg/l的mirna-206-3p溶液；

14、s2.參照步驟l2獲得物質(zhì)1；

15、s3.將步驟s2所獲物質(zhì)1溶于滅菌的rnase-free?h2o獲得質(zhì)量體積濃度為25-30mg/l的溶液3，將步驟s1所獲mirna-206-3p溶液與溶液3按照體積比1：1.2-1.6混合，以150-200w功率超聲處理2-4min，結(jié)束后加熱至30-40℃并保持15-20min，結(jié)束后立即冰水浴，即獲得干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑，保存于4℃環(huán)境備用。

16、較佳地，步驟s1中mirna-206-3p的序列為5’-uggaauguaaggaagugugugg-3’。

17、所述植物源迷迭香酸是從天然植物中提取獲得的迷迭香酸，迷迭香酸的純度≥92%，天然植物優(yōu)選薄荷、紫蘇或勿忘草。

18、本發(fā)明還提供一種用于羊膜上皮干細(xì)胞多方向誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基的制備方法，具體步驟如下：

19、將干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅰ、植物源異鼠李素、肝細(xì)胞生長因子依次添加至dmdm/f12培養(yǎng)基中，攪拌至分散均勻即獲得用于羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基ⅰ）；

20、或，將干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅱ、苔蘚抑素1、植物源迷迭香酸、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子依次添加至dmdm/f12培養(yǎng)基中，攪拌至分散均勻即獲得用于羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基ⅱ）。

21、本發(fā)明的有益效果如下：

22、長鏈非編碼rna（lncrna）是一類長度超過200個核苷酸的rna家族，參與多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡，lncrna通過多種機(jī)制發(fā)揮作用，包括作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子和表觀遺傳修飾，此外lncrna還充當(dāng)競爭性內(nèi)源性rna（cerna），通過充當(dāng)mirna的海綿參與腫瘤發(fā)生，如有研究表明lncrna?hotair/mir-1/golph3調(diào)控軸會影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。已知lncrna?hotair與mirna之間往往存在相互調(diào)控的關(guān)系，本發(fā)明采取過表達(dá)mirna-141，從而抑制內(nèi)源lncrna?hotair的表達(dá)，促進(jìn)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)將羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，此過程中還涉及改性的殼聚糖載體，該載體具有低毒、原料易得、表面反應(yīng)性好等優(yōu)勢?？紤]mirna-141的靶標(biāo)并不完全唯一，且人羊膜上皮干細(xì)胞是由異質(zhì)細(xì)胞群組成的問題，本發(fā)明進(jìn)一步將植物源異鼠李素添加至培養(yǎng)基ⅰ中。有研究采用微陣列的方式表明天然植物來源的異鼠李素或能促進(jìn)人羊膜上皮干細(xì)胞的分化，但缺少實驗數(shù)據(jù)的支持，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上選用沙棘或胡頹子來源的異鼠李素進(jìn)行實驗，單一實驗顯示該異鼠李素誘導(dǎo)分化的效率較低（相比重組生長因子等組成的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基），但植物源異鼠李素與干細(xì)胞誘導(dǎo)刺激劑ⅰ結(jié)合使用后，能有效實現(xiàn)羊膜上皮干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，最后獲得的培養(yǎng)基ⅰ，僅涉及少量肝細(xì)胞生長因子，整體培養(yǎng)基的可用性更高、毒性更低，且副作用更小，不具有大量使用重組生長因子而導(dǎo)致的毒性作用及潛在的排斥問題。

23、同樣地，本發(fā)明依舊采用改性的殼聚糖載體，對mirna-206進(jìn)行過表達(dá)，通過mirna-206/lncrna?hotair/yy1調(diào)控軸，實現(xiàn)將羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，mirna-206同樣存在如mirna-141類似的問題，本發(fā)明選用植物源迷迭香酸進(jìn)行添加，同時添加苔蘚抑素1與少量膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，最終獲得的培養(yǎng)基ⅱ，使用效果較佳。

24、本發(fā)明所獲培養(yǎng)基ⅰ，能有效將羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，所獲肝細(xì)胞樣細(xì)胞特異性表達(dá)肝細(xì)胞特征蛋白，能促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，具有肝細(xì)胞的生理功能；本發(fā)明所獲培養(yǎng)基ⅱ，能有效將羊膜上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，經(jīng)檢驗所獲細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、免疫反應(yīng)及功能檢測等方面均符合神經(jīng)元樣細(xì)胞的特征。