本技術(shù)涉及生物，尤其是涉及一株能改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎的普拉梭菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、代謝相關(guān)脂肪性肝?。╩afld）是一種主要累及肝臟的多系統(tǒng)代謝功能障礙性疾病，與肥胖、代謝紊亂和2型糖尿病均密切相關(guān)。近年來，由于人們飲食習(xí)慣呈快餐化趨勢，以及高脂肪、高糖、高熱量的飲食結(jié)構(gòu)和久坐少動(dòng)生活方式的流行，導(dǎo)致mafld患病率逐年升高。mafld以肝臟內(nèi)脂肪沉積和彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征，伴隨著炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)可進(jìn)一步發(fā)展為代謝相關(guān)脂肪肝炎（metabolic-associatedsteatohepatitis，mash），乃至肝硬化和肝癌，還會(huì)導(dǎo)致心腦血管疾病、慢性腎病等，目前臨床尚缺乏治療mafld的特效藥物。

2、faecalibacterium?prausnitzii（f.?prausnitzii），為普氏棲糞桿菌，又名：普拉梭菌，革蘭氏陰性，是柔嫩梭菌類群的優(yōu)勢菌，屬于梭菌科，厚壁菌門。普拉梭菌是人類腸道菌群中最重要的細(xì)菌之一，占健康人糞便樣本中檢測到的細(xì)菌總數(shù)的5-15%。研究表明，普拉梭菌是腸道中主要丁酸鹽生產(chǎn)者之一。丁酸鹽可以增加緊密連接蛋白的合成和抗菌肽的產(chǎn)生來參與結(jié)腸屏障的增強(qiáng)；丁酸鹽通過減少腸上皮細(xì)胞中腫瘤壞死因子(tnf)的分泌，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡，起到抗腫瘤作用。然而，普拉梭菌在代謝相關(guān)脂肪性肝病或代謝相關(guān)脂肪性肝炎中的治療作用尚不明確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一株能改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎的普拉梭菌及其應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采取的技術(shù)方案為：

3、本技術(shù)提供了一株能改善代謝相關(guān)脂肪性肝病或代謝相關(guān)脂肪性肝炎的普拉梭菌，所述普拉梭菌為faecalibacterium?prausnitziigzsy3214，所述普拉梭菌已于2024年08月07日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc?no：64992，分類名為faecalibacterium?prausnitzii，保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。

4、所述普拉梭菌（faecalibacterium?prausnitziigzsy3214）的菌落形態(tài)為：大小大約為1.5至3微米長，寬度約為0.5至0.8微米，以單個(gè)細(xì)胞或成對的形式排列，不產(chǎn)芽孢，無鞭毛、無運(yùn)動(dòng)性桿菌，在固體培養(yǎng)基中表現(xiàn)為凸面、半透明、邊緣完整且濕潤的菌落。在液體培養(yǎng)基中的形態(tài)特征表現(xiàn)為球狀、多形性小球到桿狀的一系列細(xì)胞形態(tài)。

5、所述普拉梭菌（faecalibacterium?prausnitziigzsy3214）的生理生化特性為：革蘭氏陰性，嚴(yán)格厭氧菌，對氧極度敏感，是柔嫩梭菌類群的優(yōu)勢菌，屬于梭菌科，厚壁菌門柔嫩梭菌屬。普拉梭菌通過葡萄糖酵解產(chǎn)生大量的甲酸鹽、丁酸鹽以及少量d-乳酸鹽。

6、所述普拉梭菌（faecalibacterium?prausnitziigzsy3214）參與糖代謝、氨基酸和維生素代謝、短鏈脂肪酸的產(chǎn)生等多種代謝途徑，代謝產(chǎn)物主要包括丁酸鹽和15kd微生物抗炎分子（microbial?anti-inflammatory?molecule，mam），所述普拉梭菌（faecalibacterium?prausnitziigzsy3214）只能在無氧環(huán)境中穩(wěn)定存活，最佳生長ph范圍為5.7至6.7。

7、本技術(shù)發(fā)明人經(jīng)過大量研究及試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)篩選得到的faecalibacteriumprausnitziigzsy3214，在預(yù)防、緩解、改善和/或治療代謝相關(guān)脂肪性肝病或代謝相關(guān)脂肪性肝病方面具有良好的療效，對肝臟參與炎癥反應(yīng)的信號通路具有顯著的抑制作用。

8、作為本技術(shù)所述普拉梭菌的優(yōu)選實(shí)施方式，所述普拉梭菌的16s?rdna的序列如seq?id?no：1所示。

9、本技術(shù)還提供了含有所述的普拉梭菌的產(chǎn)品。

10、作為本技術(shù)所述產(chǎn)品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述產(chǎn)品包括藥物或微生物菌劑。

11、作為本技術(shù)所述產(chǎn)品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述產(chǎn)品為微生物菌劑，所述微生物菌劑中普拉梭菌的濃度為1~6×109cfu/ml。

12、所述微生物菌劑通過以下步驟制備得到：

13、（1）將普拉梭菌的甘油菌接種至ycfa液體培養(yǎng)基中，在厭氧、35-37℃下靜置培養(yǎng)16-19h，得到一級種子液；

14、（2）將步驟（1）所得一級種子液接種至ycfa液體培養(yǎng)基中，在厭氧、35-37℃下靜置培養(yǎng)7-9h，得到二級種子液；

15、（3）將步驟（2）所得二級種子液接種至ycfa液體培養(yǎng)基中，在厭氧、35-37℃下靜置培養(yǎng)16-19h，得到普拉梭菌發(fā)酵液。

16、（4）將所得普拉梭菌發(fā)酵液在4~8℃下離心，得到普拉梭菌菌體；

17、（5）利用磷酸緩沖液重懸步驟（4）所得普拉梭菌菌體，得到普拉梭菌菌泥；

18、（6）將所得普拉梭菌菌泥與凍存保護(hù)劑混合，置于-80℃下凍存；所述普拉梭菌菌泥與凍存保護(hù)劑的體積比為1:1，制得所述微生物菌劑。

19、經(jīng)培養(yǎng)獲得的含有所述的普拉梭菌的微生物菌劑可直接加入微生物制劑領(lǐng)域允許的輔料制備為液體菌劑，也可以收集微生物菌劑中的菌體與凍干保護(hù)劑等微生物制劑領(lǐng)域允許的輔料混合制得所述微生物菌劑。

20、作為本技術(shù)所述產(chǎn)品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述產(chǎn)品為藥物，所述藥物還包括輔料。

21、作為本技術(shù)所述產(chǎn)品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述輔料包括賦形劑和附加劑。

22、在一些具體的實(shí)施方式中，所述輔料包含抗黏合劑、滲透促進(jìn)劑、緩沖劑、增塑劑、表面活性劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、吸收劑、保濕劑、溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、ph值調(diào)節(jié)劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、潤濕劑、整合劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、發(fā)泡劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑以及釋放阻滯劑。

23、在一些具體的實(shí)施方式中，所述附加劑包含微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素以及精制卵磷脂。

24、作為本技術(shù)所述產(chǎn)品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥物的劑型包括顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑和口服液中的一種。

25、本技術(shù)還提供了所述的普拉梭菌或上述產(chǎn)品在制備預(yù)防、緩解、改善和/或治療代謝相關(guān)脂肪性肝病或代謝相關(guān)脂肪性肝炎的藥物中的應(yīng)用。

26、所述應(yīng)用為以下（1）~（5）至少一種應(yīng)用：

27、（1）降低體重及肝重；

28、（2）改善肝組織病變，緩解肝細(xì)胞脂肪變性，減少肝細(xì)胞氣球樣變；

29、（3）改善肝功能及脂代謝，下調(diào)alt、ast、tg及l(fā)dl的含量；

30、（4）抑制炎癥相關(guān)mapk、nf-κb、炎性細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)；

31、（5）抑制肝纖維化相關(guān)膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β的表達(dá)。

32、本技術(shù)還選用兩種典型的代謝相關(guān)脂肪性肝?。╩afld）和代謝相關(guān)脂肪性肝炎（mash）動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即（1）自發(fā)的2型糖尿病小鼠（db/db）給予高脂高糖高膽固醇的西方飲食；（2）蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（mcd），可以更好地模擬代謝相關(guān)脂肪性肝病或代謝相關(guān)脂肪性肝炎的疾病進(jìn)程。

33、經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可知，與代表菌株a2-165相比，采用本技術(shù)的faecalibacteriumprausnitziigzsy3214處理后，可以顯著降低小鼠的體重及肝重，且小鼠的肝細(xì)胞脂肪變性可以得到緩解，肝組織病變可以得到改善，肝細(xì)胞氣球樣變減少。表明，本技術(shù)的faecalibacterium?prausnitziigzsy3214可以顯著改善西方飲食誘導(dǎo)的mafld小鼠肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)。本技術(shù)的faecalibacterium?prausnitziigzsy3214還可以有效抑制mcd飲食誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞氣球樣變和纖維化，降低血清alt，ast和tnfα水平，具有改善mash的作用，且gzsy3214對mash的改善效果優(yōu)于a2-165菌株。

34、并且，與代表菌株a2-165相比，采用本技術(shù)的faecalibacteriumprausnitziigzsy3214處理后小鼠的alt、ast、tg及l(fā)dl均顯著下降（p<0.05），可以顯著抑制炎癥相關(guān)mapk、nf-kappa?b（nf-κb）、炎性細(xì)胞因子、趨化因子等信號通路分子的表達(dá)，顯著抑制肝纖維化相關(guān)膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β的表達(dá)，還可以顯著降低wd非誘導(dǎo)的1143個(gè)基因的表達(dá)（profile?3），這群基因在細(xì)胞因子-受體相互作用（cytokine-cytokinereceptor?interaction）、鈣離子信號通路（calcium?signaling?pathway）、抗原處理和遞呈（antigen?processing?and?presentation）等信號通路中富集。以上結(jié)果顯示，采用faecalibacterium?prausnitziigzsy3214處理后在改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎疾病進(jìn)展方面具有良好的療效。

35、此外，faecalibacterium?prausnitziigzsy3214還可通過依賴于ikk的nf-κb經(jīng)典途徑和依賴于nik的非經(jīng)典途徑影響整條通路代謝，進(jìn)而影響代謝相關(guān)脂肪性肝病的炎癥反應(yīng)。

36、綜上所述，采用faecalibacterium?prausnitziigzsy3214處理后在治療代謝相關(guān)脂肪性肝炎的炎癥反應(yīng)方面具有良好的療效，對肝臟參與炎癥反應(yīng)的nf-κb和mapk信號通路具有顯著的抑制作用。

37、本技術(shù)還提供了所述的普拉梭菌或上述的產(chǎn)品在制備降低肝臟功能指標(biāo)和血脂因子水平的藥物中的應(yīng)用。

38、作為本技術(shù)所述應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方式，所述肝臟功能指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶或谷草轉(zhuǎn)氨酶；所述血脂因子包括甘油三酯或低密度脂蛋白。

39、本技術(shù)還提供了所述的普拉梭菌或上述產(chǎn)品在制備降低炎癥信號通路分子表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

40、作為本技術(shù)所述應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方式，所述炎癥信號通路分子包括mapk、nf-κb、炎性細(xì)胞因子和趨化因子中的至少一種。

41、在本技術(shù)的技術(shù)方案中，采用本技術(shù)的faecalibacterium?prausnitziigzsy3214處理后小鼠的alt、ast、tg及l(fā)dl等肝臟和血脂因子均顯著下降（p<0.05）。

42、并且該菌株可以顯著抑制炎癥相關(guān)mapk、nf-kappa?b（nf-κb）、炎性細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)，還可以顯著抑制肝纖維化相關(guān)膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β的表達(dá)，還可以顯著降低wd非誘導(dǎo)的1143個(gè)基因的表達(dá)（profile?3）。說明采用本技術(shù)的faecalibacterium?prausnitziigzsy3214處理可以顯著抑制代謝相關(guān)脂肪性肝炎的炎癥反應(yīng)，有利于治療代謝相關(guān)脂肪性肝炎。

43、此外，本技術(shù)的faecalibacterium?prausnitziigzsy3214還可以應(yīng)用于食品、飲品、保健品、腸內(nèi)營養(yǎng)劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑等方面，應(yīng)用不僅僅局限于上述。

44、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

45、本技術(shù)提供了一株能改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎的普拉梭菌及其應(yīng)用，采用本技術(shù)篩選得到的普拉梭菌（faecalibacteriumprausnitziigzsy3214）處理后在治療代謝相關(guān)脂肪性肝炎疾病進(jìn)展方面具有良好的療效，對肝臟參與炎癥反應(yīng)的nf-κb和mapk信號通路具有顯著的抑制作用；其中，采用faecalibacterium?prausnitziigzsy3214處理代謝相關(guān)脂肪性肝病或代謝相關(guān)脂肪性肝炎動(dòng)物模型，可以改善肝組織病變，緩解肝細(xì)胞脂肪變性，減少肝細(xì)胞氣球樣變。并且該菌株還可以改善肝功能及脂代謝，下調(diào)alt、ast、tg及l(fā)dl等含量，及抑制炎癥相關(guān)mapk、nf-κb、炎性細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)，顯著抑制肝纖維化相關(guān)膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β的表達(dá)。