本發(fā)明涉及遺傳轉(zhuǎn)化，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茄子毛狀根轉(zhuǎn)基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

1、茄子是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜作物，但是由于茄子栽培種的遺傳基礎(chǔ)狹窄且種間群體構(gòu)建困難等原因，很難利用常規(guī)育種實(shí)現(xiàn)優(yōu)異性狀的快速高效聚合，茄子的遺傳轉(zhuǎn)化體系仍不成熟且基因型依賴性強(qiáng)，在一定程度上限制了茄子分子育種和基礎(chǔ)理論研究等的進(jìn)程，目前關(guān)于茄子生物育種技術(shù)發(fā)展相對(duì)薄弱，能夠快速、準(zhǔn)確得到穩(wěn)定遺傳性狀的優(yōu)良品種尤其困難。本發(fā)明旨在通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌作為介導(dǎo)途徑，將外源目的基因快速準(zhǔn)確穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化整合到茄子基因組中，該毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可用于茄子基因編輯體系效率的評(píng)價(jià)，為茄子基因功能研究和生物育種提供新的途徑，是茄子穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的重要補(bǔ)充。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茄子毛狀根轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、步驟a1：外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；

4、步驟a2：農(nóng)桿菌菌落pcr的驗(yàn)證；

5、步驟a3：茄子催芽與播種；

6、步驟a4：侵染液的制備；

7、步驟a5：發(fā)根農(nóng)桿菌侵染茄子幼苗；

8、步驟a6：毛狀根的誘導(dǎo)；

9、步驟a7：陽(yáng)性植株的鑒定。

10、步驟a1：發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的步驟具體為采用熱激法將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞k599中。優(yōu)選的，所述步驟a1中將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞具體步驟如下：

11、步驟a11：將-80℃超低溫冰箱中取出保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)，于室溫或在手中片刻待其部分融化，處于冰水混合物狀態(tài)時(shí)插入冰中；

12、步驟a12：每50μg的感受態(tài)加入0.5μg質(zhì)粒dna，用手輕輕撥打管底使其混勻；依次于冰上靜置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

13、步驟a13：加入700μl無(wú)抗生素的lb液體培養(yǎng)基，于28℃搖床200r/min震蕩培養(yǎng)2-3h；

14、步驟a14:將搖渾濁的菌液6000r離心1min收集菌體，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的lb固體培養(yǎng)基上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d。

15、步驟a2：農(nóng)桿菌菌落pcr目的基因驗(yàn)證方法具體為：

16、步驟a21：將轉(zhuǎn)化完成的農(nóng)桿菌挑取單菌落，在含有相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)基中劃短線，置于28℃培養(yǎng)箱48h；

17、步驟a22：農(nóng)桿菌菌落pcr擴(kuò)增反應(yīng)所用試劑總體積為20μl，其反應(yīng)體系包含2×rapid?taq?master?mix10μl、primer?f?0.8μl、primer?r?0.8μl、ddh2o?7.4μl、dna?1μl；

18、步驟a23：含有35s-ruby載體驗(yàn)證引物序列包含上游引物primer?f：tgtgaacatggtggagca；下游引物primer?r：tgaatcttggcgaggttg;

19、步驟a24：含有dsred（rfp）載體驗(yàn)證引物序列包含上游引物primer?f：taagggatgacgcacaat；下游引物primer?r：cctacaggaacaggtggtg

20、步驟a25：pcr反應(yīng)步驟為95℃預(yù)變性3min、95℃變性15sec、60℃退火15sec、72℃延伸15sec，返回95℃變性15sec進(jìn)行35次循環(huán)、72℃終延伸5min、4℃保存；

21、步驟a26：瓊脂糖凝膠電泳具體步驟為：量取100ml?1×tae?電泳緩沖液向其中加入1g瓊脂糖粉，加熱沸騰至完全溶解，加入10μl核酸染料（10000×），混勻倒入模具中，凝固后待用；將凝固好的凝膠放入盛有1×tae電泳緩沖液的電泳槽中，與目的條帶匹配的marker加入點(diǎn)樣孔作為對(duì)照，pcr產(chǎn)物按順序加入后面的點(diǎn)樣孔中；150v，400ma電泳20min；凝膠成像分析儀檢測(cè)結(jié)果。

22、步驟a27：蘸取步驟a21中劃線長(zhǎng)出的單菌落為模板，陽(yáng)性對(duì)照以載體質(zhì)粒為模板，陰性對(duì)照中加入1μl無(wú)菌水，加入步驟a24所示引物，配置步驟a22所示20μl反應(yīng)體系，通過(guò)步驟a25所示pcr擴(kuò)增循環(huán)，結(jié)束后取10μl?pcr產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

23、步驟a28：挑取陽(yáng)性單克隆菌株，放入含相應(yīng)抗生素的yep液體培養(yǎng)基，在28℃、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，吸取1ml菌液，加入約150ml左右滅菌的甘油，于-80℃超低溫冰箱保存甘油菌。

24、步驟a3：茄子催芽與播種。方法具體為：將供試茄子種子放入兩層濾紙中間，置于培養(yǎng)皿中，用400ppm赤霉素潤(rùn)濕濾紙，將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中催芽12-48h，待種子露白后，直接播種在裝有基質(zhì)的穴盤中，置于植物光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。幼苗生長(zhǎng)至兩片子葉時(shí)用于后續(xù)侵染試驗(yàn)。

25、步驟a4：侵染液的制備。

26、優(yōu)選的，侵染也制備具體步驟如下：

27、步驟a41:菌株活化：將-80℃冰箱保存的甘油菌在含有相應(yīng)抗生素的yep固體培養(yǎng)基上均勻涂布后倒置活化培養(yǎng)2d，用無(wú)菌的槍頭挑取單菌落接種于500μl?yep液體培養(yǎng)基中，28℃、200r?min-1振蕩培養(yǎng)12h；

28、步驟a42:侵染液制備：吸取100μl活化的菌液接種于100ml?yep液體培養(yǎng)基中繼續(xù)過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，待菌液od600值為0.8時(shí)，集菌后重懸于緩沖液，靜置3h后備用。

29、步驟a5：含目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染茄子幼苗。

30、優(yōu)選的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染步驟具體為：

31、步驟a51：制備mes侵染液，mes緩沖液包括10mm?mgcl2、10mm?mes、100μm乙酰丁香酮，ph調(diào)整為5.7，過(guò)濾除菌，集菌后重懸；

32、步驟a52:菌液浸泡法：在幼苗根莖處將主根系剪除，隨后幼苗切口浸入活化菌液中，超聲波處理60s，浸入深度3cm左右，浸染時(shí)間30min。

33、步驟a6：毛狀根的誘導(dǎo)。

34、優(yōu)選的毛狀根誘導(dǎo)方法具體為：

35、步驟a61：侵染后將幼苗移栽到基質(zhì)中，使用基質(zhì)覆蓋侵染部位；

36、步驟a62：在覆土后向基質(zhì)中澆灌1ml菌液；

37、步驟a63：蓋上育苗盤透明保濕罩，在黑暗條件下共培養(yǎng)2d；

38、步驟a64：共培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至正常光照條件下培養(yǎng)，注意定期噴水保濕（禁止在托盤中大量澆水）。

39、步驟a7：陽(yáng)性植株的鑒定方法具體為：培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)成功誘導(dǎo)出的毛狀根的株數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

40、轉(zhuǎn)化率=（帶有陽(yáng)性根的植株數(shù)/侵染植株總數(shù)）×100%

41、本發(fā)明的技術(shù)效果和優(yōu)點(diǎn)：

42、1、發(fā)根農(nóng)桿菌（ agrobacterium?rhizogenes）是一類宿主范圍廣泛的革蘭氏陰性菌，其ri質(zhì)粒可被靶基因修飾，將遺傳物質(zhì)整合到植物基因組中。

43、2、發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化體系具有操作簡(jiǎn)便、周期短、轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)。

44、3、本發(fā)明充分利用了茄子幼苗時(shí)期分化能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短的特點(diǎn)，對(duì)于茄子基因編輯體系的建立和基因功能研究具有重要意義。