本發(fā)明涉及生物檢測，具體涉及一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的引物、探針和檢測方法。

背景技術(shù)：

1、豬鏈球菌(streptococcus?suis)是一種重要的動物病原體，主要影響豬，并可引起一系列嚴(yán)重的疾病，包括腦膜炎、敗血癥和關(guān)節(jié)炎。該病原體不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成了顯著經(jīng)濟損失，還能感染人類，導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題，尤其是在接觸豬的高風(fēng)險人群中。豬鏈球菌即使存在于健康豬群中，也可能具有導(dǎo)致疾病的能力，這對生豬的健康養(yǎng)殖、相關(guān)行業(yè)工作者以及豬肉制品的消費者都構(gòu)成了潛在風(fēng)險。自20世紀(jì)50年代在歐洲首次記錄到豬感染豬鏈球菌的病例，到60年代在丹麥?zhǔn)状伟l(fā)現(xiàn)人類感染此菌，全球已多次報告了人畜共患豬鏈球菌感染的疫情。豬鏈球菌在自然界中廣泛分布，并且存在多種血清型。據(jù)目前了解，已有15種血清型的豬鏈球菌能夠引發(fā)豬只發(fā)病，而12種血清型則對人類具有致病性，這對生豬養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

2、準(zhǔn)確且及時的檢測對于有效控制豬鏈球菌感染至關(guān)重要。在生豬養(yǎng)殖中，為了分離鑒定和早期診斷豬鏈球菌，傳統(tǒng)上采用微生物分離培養(yǎng)或pcr等分子生物學(xué)手段。然而，豬鏈球菌作為一種兼性厭氧菌，其培養(yǎng)過程復(fù)雜且耗時，通常需要4至7天，且該菌對營養(yǎng)要求較高。此外，它在普通培養(yǎng)基上生長困難，并易于受到變形桿菌、淺綠氣球菌、不動桿菌等其他細(xì)菌的污染，從而增加了獲得純培養(yǎng)物的難度。相比之下，pcr方法雖然基于特異性引物對靶標(biāo)基因進行dna體外擴增，具有高度的敏感性，但它對溫度控制嚴(yán)格，并需要專業(yè)設(shè)備的支持。這兩種方法在豬鏈球菌的現(xiàn)場快速檢測中均存在一定的局限性。因此，研發(fā)一種能夠迅速且準(zhǔn)確檢測豬鏈球菌的新技術(shù)，對于維護公共衛(wèi)生安全和促進生豬養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。

3、重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(raa技術(shù))利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白以及dna聚合酶等酶類，在等溫條件下(通常在37～42℃范圍內(nèi))進行核酸擴增。raa技術(shù)以其等溫擴增、快速出結(jié)果、高靈敏度、高特異性和操作簡單等特點，在食品安全、動物疫病檢測、環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷等多個領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景。recn基因是豬鏈球菌的重要遺傳標(biāo)記，研究表明recn基因在不同鏈球菌屬中的差異性較大，同時在豬鏈球菌中均存在且保守，適合作為鑒別豬鏈球菌的靶標(biāo)基因。

4、本研究旨在基于熒光型raa技術(shù)，針對recn基因建立一種快速、靈敏的豬鏈球菌檢測方法，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和檢測流程，提供一種有效的工具，用于豬鏈球菌的早期檢測和監(jiān)測，從而為防控該病原體的傳播提供支持。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的引物、探針和檢測方法，為解決豬鏈球菌的快速準(zhǔn)確的檢測。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測豬鏈球菌的raa引物，該raa引物包含上游引物和下游引物，其中，上、下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.9所示。

3、本發(fā)明還提供了一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的引物組合物，該引物組合物包含探針引物和上述的raa引物，其中探針引物的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。其中，該探針引物是在如原核苷酸序列如seq?id?no.11所示序列的基礎(chǔ)上，在該序列的5'端第31位堿基t標(biāo)記一個熒光基團i6fam，在第33位的堿基a用四氫呋喃殘基(thf)替換，在第34位堿基t標(biāo)記一個淬滅基團ibhq1，在該序列的3'端進行c3?spacer修飾所得。

4、本發(fā)明還提供了一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的試劑盒，該試劑盒包含上述的探針引物和raa引物。

5、本發(fā)明提供的引物組合物或試劑盒可用于以下任意一項中，包含：豬鏈球菌的檢測、豬鏈球菌的病原學(xué)特點的研究、豬鏈球菌感染的預(yù)防和檢測。

6、本發(fā)明還提供了一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的檢測方法，通過raa反應(yīng)體系進行檢測，該raa反應(yīng)體系中raa引物的核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.9所示，其中探針引物的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

7、優(yōu)選的，上述反應(yīng)體系中探針引物的濃度為10μm，用量為總體積的4％。

8、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

9、本發(fā)明基于熒光raa技術(shù)，根據(jù)豬鏈球菌的重要遺傳標(biāo)記基因recn，開發(fā)了一種特異性檢測recn基因的raa引物和探針引物，并優(yōu)化得到了一種高特異性、準(zhǔn)確性的豬鏈球菌檢測方法，通過本發(fā)明提供的引物及其反應(yīng)體系可特異性地對多種分型的豬鏈球菌進行檢測，相比普通pcr具有更高的準(zhǔn)確率，有效避免了假陽性的出現(xiàn)，30min內(nèi)可以得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，且特異性高，不會與樣本中其他種類的細(xì)菌進行交叉反應(yīng)，在豬鏈球菌的檢測和環(huán)境檢測中具有應(yīng)用潛力。

技術(shù)特征：

1.一種檢測豬鏈球菌的raa引物，其特征在于，所述raa引物包含上游引物和下游引物，所述上、下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.9所示。

2.一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物包含探針引物和權(quán)利要求1所述的raa引物，所述探針引物的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物組合物，其特征在于，所述的探針引物是在如原核苷酸序列如seq?id?no.11所示序列的基礎(chǔ)上，在該序列的5'端第31位堿基t標(biāo)記一個熒光基團i6fam，在第33位的堿基a用四氫呋喃殘基替換，在第34位堿基t標(biāo)記一個淬滅基團ibhq1，在該序列的3'端進行c3?spacer修飾所得。

4.一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求3所述的引物組合物。

5.如權(quán)利要求3所述的引物組合物或權(quán)利要求4所述的試劑盒在一下任意一項中的應(yīng)用；

6.一種基于熒光型raa技術(shù)檢測豬鏈球菌的檢測方法，其特征在于，通過raa反應(yīng)體系進行檢測，該raa反應(yīng)體系中raa引物的核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.9所示，其中探針引物的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述探針引物的濃度為10μm。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述探針引物在體系中的用量為總體積的4％。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于熒光型RAA技術(shù)檢測豬鏈球菌的RAA引物、探針引物和檢測方法，該RAA引物包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.9所示上、下游引物，還包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.12所示的探針引物。本發(fā)明還提供了一種RAA熒光反應(yīng)體系，其中探針引物的濃度為10μM，在體系中的體積占比為4％。本發(fā)明提供反應(yīng)體系可用于豬鏈球菌的檢測，還可以用于豬鏈球菌的病原學(xué)特點的研究，在豬鏈球菌感染的預(yù)防和檢測中也具有應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：雷昌偉,周長宇,林恒,王紅寧
受保護的技術(shù)使用者：四川大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9