本發(fā)明屬于植物基因工程，具體涉及耐高溫棉花種質(zhì)ghcki-pro5和ghcki-pro6的創(chuàng)制方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，然而目前夏季高溫發(fā)生頻率較高，高溫持續(xù)時(shí)間也會(huì)更長(zhǎng)。棉花是喜溫作物，但劇烈的高溫脅迫會(huì)造成棉花生育期生理活動(dòng)紊亂，影響棉花的品質(zhì)及產(chǎn)量，甚至造成植株死亡。高溫既影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)也影響生殖生長(zhǎng)，但相較于葉片等營(yíng)養(yǎng)器官，高溫對(duì)生殖器官的影響更為嚴(yán)重(ahmad?et?al.,2021)。植物的生殖器官包括雌蕊和雄蕊，當(dāng)遭受高溫脅迫時(shí)，雄蕊相比于雌蕊對(duì)高溫更加敏感(zhang?et?al.,2021)。高溫會(huì)導(dǎo)致花粉活力下降、花藥不開(kāi)裂、蕾鈴脫落等，進(jìn)而影響結(jié)實(shí)率和種子產(chǎn)量。此外，高溫還會(huì)導(dǎo)致纖維長(zhǎng)度和強(qiáng)度降低，影響棉花品質(zhì)。因此創(chuàng)制棉花耐高溫種質(zhì)顯得極為必要。

2、目前，棉花耐高溫育種主要采用傳統(tǒng)育種方法和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。傳統(tǒng)育種方法周期長(zhǎng)、效率低，難以滿足快速育種的需求。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以有效的將耐高溫基因?qū)朊藁?，但存在一定的安全性和倫理?wèn)題。因此研發(fā)一種安全、快速獲得耐高溫棉花種質(zhì)的方法是現(xiàn)階段解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供了耐高溫棉花種質(zhì)ghcki-pro5和ghcki-pro6的創(chuàng)制方法及應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)crispr/lbcpf1基因編輯技術(shù)獲得含編輯后ghcki基因啟動(dòng)子的植株在高溫下仍能保持一定的育性，保持了高溫下棉花產(chǎn)量，為棉花耐高溫育種提供了重要的種質(zhì)資源。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種棉花耐高溫編輯后ghcki基因啟動(dòng)子，所述編輯后ghcki基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示。

4、本發(fā)明提供所述的編輯后ghcki基因啟動(dòng)子在創(chuàng)制棉花耐高溫株系中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明提供一種編輯棉花ghcki基因啟動(dòng)子的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

6、本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，包括所述的sgrna。

7、優(yōu)選的，將所述的sgrna通過(guò)infusion體系連接至crispr/lbcpf1載體上，得到重組表達(dá)載體。

8、本發(fā)明提供一種重組菌，包含所述的重組表達(dá)載體。

9、本發(fā)明提供所述的sgrna或所述的重組表達(dá)載體或所述的重組菌在創(chuàng)制棉花耐高溫株系中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明提供一種創(chuàng)制棉花耐高溫株系的方法，包括如下步驟：將所述重組表達(dá)載體通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式轉(zhuǎn)化至野生棉花植株中，得到ghcki基因啟動(dòng)子被編輯后的棉花耐高溫株系。

11、優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因的方式包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。

12、本發(fā)明提供所述的方法在創(chuàng)制棉花耐高溫株系中的應(yīng)用。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

14、本發(fā)明通過(guò)crispr/lbcpf1基因編輯技術(shù)敲除ghcki基因啟動(dòng)子區(qū)域myb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)側(cè)翼序列或myb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，獲得編輯后ghcki基因啟動(dòng)子，含有該編輯后ghcki基因啟動(dòng)子的棉花植株在高溫下仍能保持一定的育性，保持了高溫下棉花產(chǎn)量，為棉花耐高溫育種提供了重要的種質(zhì)資源。

15、進(jìn)一步的，本發(fā)明基于ghcki基因啟動(dòng)子編輯創(chuàng)制棉花耐高溫種質(zhì)的方法具有操作簡(jiǎn)便、效率高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，為棉花耐高溫育種提供了一種新的技術(shù)手段。而基因編輯技術(shù)中cpf1蛋白可以識(shí)別富含堿基t的5＇端的pam序列，相較于cas9識(shí)別富含堿基g的3＇端pam序列(ngg)，t堿基在生物基因組中有更廣覆蓋率，尤其啟動(dòng)子中富含t序列，為我們編輯啟動(dòng)子提供了新的思路。

技術(shù)特征：

1.一種棉花耐高溫編輯后ghcki基因啟動(dòng)子，其特征在于，所述編輯后ghcki基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示。

2.權(quán)利要求1所述的編輯后ghcki基因啟動(dòng)子在創(chuàng)制棉花耐高溫株系中的應(yīng)用。

3.一種編輯棉花ghcki基因啟動(dòng)子的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，包括權(quán)利要求3所述的sgrna。

5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，將所述的sgrna通過(guò)infusion體系連接至crispr/lbcpf1載體上，得到重組表達(dá)載體。

6.一種重組菌，其特征在于，包含權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體。

7.如權(quán)利要求3所述的sgrna或權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求6所述的重組菌在創(chuàng)制棉花耐高溫株系中的應(yīng)用。

8.一種創(chuàng)制棉花耐高溫株系的方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因的方式包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。

10.如權(quán)利要求8或9所述的方法在創(chuàng)制棉花耐高溫株系中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供耐高溫棉花種質(zhì)GhCKI?Pro5和GhCKI?Pro6的創(chuàng)制方法及應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了與棉花耐高溫性狀相關(guān)編輯后GhCKI基因啟動(dòng)子，核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示。本發(fā)明通過(guò)編輯后獲得編輯后GhCKI基因啟動(dòng)子，含有該編輯后GhCKI基因啟動(dòng)子的棉花植株在高溫下仍能保持一定的育性，保持了高溫下棉花產(chǎn)量，為棉花耐高溫育種提供了重要的種質(zhì)資源。

技術(shù)研發(fā)人員：閔玲,付一諾,李焱龍,范亞茹,楊靜,孔杰,郭小平,梁亞軍,張銀寶,朱龍付,張獻(xiàn)龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6