本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種針對(duì)大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是人和幼畜腹瀉的最常見的病原性大腸桿菌，嚴(yán)重時(shí)可致死。其可以通過食物、水源、糞便等多種途徑傳播，增加了大腸桿菌在幼畜、雛禽、以及人類中爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，不但對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，更會(huì)嚴(yán)重威脅到人類健康。此外，大腸桿菌也是臨床上分離出來(lái)的最常見耐藥菌株之一。

2、以往，畜禽飼料中添加抗生素是防治因大腸桿菌感染導(dǎo)致腹瀉等疾病的主要措施。然而，在禁止抗生素濫用的背景下，尋求有效的替代方案以防治畜禽大腸桿菌病，已成為保障養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和當(dāng)務(wù)之急。抗菌肽是一類天然小分子多肽，具有廣泛的來(lái)源和高安全性，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，因其獨(dú)特的細(xì)胞膜作用機(jī)制而不易產(chǎn)生耐藥性?？咕牟粌H具有抗菌活性，還對(duì)病毒、寄生蟲和腫瘤等有殺傷作用。因此，抗菌肽已成為生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，尤其在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

3、然而，現(xiàn)有的大多數(shù)抗菌肽仍以廣譜抗菌為主，殺滅致病菌的同時(shí)也無(wú)差別地殺滅其他有益細(xì)菌，打破菌群平衡，降低腸道穩(wěn)態(tài)，從而降低畜禽的抵抗力。因此，設(shè)計(jì)一種能夠選擇性殺滅畜禽體內(nèi)大腸桿菌，而對(duì)正常細(xì)菌無(wú)作用或作用較小的靶向肽具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于以上不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk，對(duì)大腸桿菌k88具有靶向性。

2、本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk的序列如seqid?no.1所示。

3、本發(fā)明的另一目的是提供如上所述的一種大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk的制備方法，如下：通過噬菌體展示七肽庫(kù)(ph.d.tm.-7phage?display?peptide?library)篩選得到的具有大腸桿菌親和力的短肽hi，其序列如seq?id?no.2所示，該短肽具有與大腸桿菌結(jié)合功能而不具備殺菌活性；在所述的短肽hi的基礎(chǔ)上，添加一條活性肽wk，其序列如seqid?no.3所示。最后將所述的短肽hi與活性肽wk進(jìn)行連接，得到多肽hi-wk，其序列如seq?idno.1所示；采用固相化學(xué)合成法，再經(jīng)過反相高效液相色譜純化和質(zhì)譜鑒定后，完成所述的多肽的制備，再經(jīng)過抗菌活性的測(cè)定、溶血活性的測(cè)定和真核細(xì)胞毒性的測(cè)定，最終命名為抗菌肽hi-wk。

4、本發(fā)明的另一目的是提供如上所述的一種針對(duì)大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk在制備治療由大腸桿菌k88感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。

5、進(jìn)一步的，所述的應(yīng)用為畜牧生產(chǎn)中作為飼料添加劑來(lái)治療大腸桿菌k88感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明的另一目的是提供如上所述的一種適用于治療大腸桿菌k88感染的藥物，所述藥物含有如上所述的抗菌肽hi-wk。

7、本發(fā)明的有益效果及優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明的方法通過噬菌體展示肽庫(kù)篩選得到的具有大腸桿菌親和力的短肽hi，其序列為：himpiqa，該序列具有與大腸桿菌結(jié)合功能而不具備殺菌活性；在該親和序列的基礎(chǔ)上，結(jié)合構(gòu)效關(guān)系研究在該序列的基礎(chǔ)上添加一條活性肽wk，其序列為：wkwpkpkpkpkwkw用以提高對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的穿透性。對(duì)得到的抗菌肽進(jìn)行抗菌和溶血活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽hi-wk與活性肽wk相比，對(duì)大腸桿菌k88的抑菌活性提高，而對(duì)于其它細(xì)菌活性下降?？咕膆i-wk對(duì)大腸桿菌k88最小抑菌濃度的相比于活性肽wk提高了2倍，而對(duì)于其它大腸桿菌的最小抑菌濃度的幾何平均數(shù)下降了1.78倍。而且靶向肽對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌等具有非常弱或無(wú)抑菌活性。此外，抗菌肽hi-wk在濃度為128μm時(shí)未表現(xiàn)出溶血活性。而且具有較低的溶血活性和真核細(xì)胞毒性，該抗菌肽hi-wk在128μm濃度下造成2.3％的紅細(xì)胞溶血，未能引起10％的紅細(xì)胞溶血，在128μm濃度下豬小腸上皮細(xì)胞ipec-j2的存活率達(dá)到了90.28％，綜上所述，抗菌肽hi-wk是一種典型的靶向抗菌肽，對(duì)大腸桿菌k88具有強(qiáng)烈的靶向性，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，其已具備成為飼用抗生素替代物的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

技術(shù)特征：

1.一種針對(duì)大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk，其特征在于，其序列如seq?idno.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk的制備方法，其特征在于，方法如下：通過噬菌體展示七肽庫(kù)篩選得到的具有大腸桿菌親和力的短肽hi，其序列如seq?id?no.2所示，在所述的短肽hi的c末端連接活性肽wk，所述的活性肽wk序列如seqid?no.3所示，得到多肽hi-wk，其序列如seq?id?no.1所示；采用固相化學(xué)合成法，再經(jīng)過反相高效液相色譜純化和質(zhì)譜鑒定后，完成所述的多肽的制備，再經(jīng)過抗菌活性的測(cè)定、溶血活性的測(cè)定和真核細(xì)胞毒性的測(cè)定，最終命名為抗菌肽hi-wk。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)大腸桿菌k88的靶向抗菌肽hi-wk在制備治療大腸桿菌k88感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的應(yīng)用為畜牧生產(chǎn)中作為飼料添加劑來(lái)治療大腸桿菌k88感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

5.一種適用于治療大腸桿菌k88感染的藥物，所述藥物含有如權(quán)利要求1所述的抗菌肽hi-wk。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種靶向大腸桿菌K88的靶向抗菌肽HI?WK及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其序列如SEQ?ID?No.1所示。通過噬菌體展示七肽文庫(kù)篩選得到的具有大腸桿菌親和力的肽段HI，在該親和序列的基礎(chǔ)上，添加一條活性肽WK，其序列如SEQ?ID?No.3所示，用以提高對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的穿透性，得到抗菌肽HI?WK。進(jìn)行生物安全性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗菌肽HI?WK對(duì)大腸桿菌K88最小抑菌濃度的相比于活性肽WK提高了2倍，而對(duì)于其它大腸桿菌的最小抑菌濃度的幾何平均數(shù)下降了1.78倍。此外，抗菌肽HI?WK在濃度為128μM時(shí)未表現(xiàn)出溶血活性，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：董娜,胡明陽(yáng),查斯娜,李毓雯,趙璐
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6