本發(fā)明屬于生物，具體涉及蘿卜rsnramp5重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在促進蘿卜鎘吸收與活性氧累積方面的應用。

背景技術(shù)：

1、鎘(cd)是一種生物毒性極強的重金屬元素，在環(huán)境中具有很強的流動性和隱蔽性。植物對cd過度吸收和積累會導致細胞的線粒體數(shù)量減少，破壞類囊體膜結(jié)構(gòu)，抑制光合作用和呼吸作用，導致作物產(chǎn)量和質(zhì)量急劇下降。此外，過量的cd可通過食物鏈進入人體，導致人體多個器官的慢性損傷。因此，如何有效控制植物體cd吸收累積對于食品安全和人類健康至關(guān)重要。

2、蘿卜(raphanus?sativus?l.)是十字花科蘿卜屬重要的根菜類蔬菜，營養(yǎng)豐富，其肉質(zhì)根易富集重金屬離子，并可通過食物鏈威脅人類健康。重金屬cd吸收累積成為蘿卜高品質(zhì)栽培與安全生產(chǎn)的重要限制因素。nramp(natural?resistance-associatedmacrophage?protein)是一類重要的金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白，其包含10～12個跨膜結(jié)構(gòu)域，可轉(zhuǎn)運cd、pb、zn、mn等金屬離子。擬南芥中，除atnramp4之外，另外五個atnramp均參與cd和mn的運輸。atnramp3、atnramp4和atnramp6定位于液泡膜，并參與液泡中fe運輸。水稻中，osnramp1參與fe和cd吸收，而osnramp3和osnramp4分別參與fe和al運輸。osnramp?5是一種主要的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白，負責水稻中cd吸收以及fe和mn運輸。相關(guān)研究結(jié)果為分析rsnramp5基因在蘿卜cd吸收累積中的生物學功能及低cd累積性狀遺傳改良提供重要的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種涉及蘿卜rsnramp5重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在蘿卜cd吸收與活性氧累積方面的應用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：

3、(1)克隆蘿卜rsnramp5基因編碼區(qū)與啟動子序列。核苷酸序列如序列表seq?idno：1所示，啟動子序列表如序列表seq?id?no：2所示。

4、(2)利用rt-qpcr技術(shù)驗證rsnramp5基因在cd脅迫下上調(diào)表達。

5、(3)利用同源重組方法，將rsnramp5基因cds序列分別重組至pcambia1300、ptck303、pyes2.0載體，構(gòu)建35s：：rsnramp5、rnai：：rsnramp5、pyes2-rsnramp5目的基因重組質(zhì)粒。

6、(4)通過liac-peg轉(zhuǎn)化法將pyes2-rsnramp3、pyes2-rsnramp4、pyes2-rsnramp5和pyes2空載整合到酵母感受態(tài)by4741中，對酵母細胞進行cdcl2(0μm、25μm、50μm)的處理。通過異源酵母表達分析表明，rsnramp5具有轉(zhuǎn)運酵母中cd2+的能力，并促進酵母中cd2+的吸收。

7、(5)在黑暗條件下，將攜帶prorsnramp5-gus載體的根癌農(nóng)桿菌gv3101菌液注射蘿卜子葉，用50μm?cdcl2處理12h。然后，將蘿卜子葉放置于β-葡萄糖苷酶(gus)染料中，37℃染色24h。結(jié)果表明，rsnramp5的啟動子活性顯著受到cd誘導。

8、(6)將35s：：rsnramp5、rnai：：rsnramp5、pcambia1300空載基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌gv3101中，利用農(nóng)桿菌瞬時注射蘿卜子葉技術(shù)，將其滲透到兩周大的蘿卜幼苗中，使用50μm?cdcl2進行處理，以1/2?hoagland營養(yǎng)液為對照，通過對蘿卜子葉進行dab與nbt染色，以及h2o2與o2·-含量的測定，表明過表達rsnramp5可增強蘿卜子葉中活性氧累積。

9、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

10、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)rsnramp5具有cd轉(zhuǎn)運活性，并促進酵母中cd2+的吸收。rsnramp5過表達促進植物中cd吸收與活性氧累積，本研究的結(jié)果不僅有助于深入闡明rsnramp5介導的蘿卜cd吸收與運輸?shù)恼{(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，而且為蘿卜低cd含量種質(zhì)創(chuàng)制與新品種培育提供了新的靶標。

技術(shù)特征：

1.rsnramp5重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在蘿卜鎘吸收與活性氧累積方面的應用，其特點表現(xiàn)在，核苷酸序列如序列表seq?id?no：1所示，啟動子序列表如序列表seq?id?no：2所示。

2.一種用于擴增cdna權(quán)利要求1所述rsnramp5基因的引物對，其特點表現(xiàn)在，所述引物對的堿基序列，如seq?id?no：3-seq?id?no：4所示。

3.一種用于權(quán)利要求1所述編碼rsnramp5基因的熒光定量pcr分析引物對，其特點表現(xiàn)在，所述引物對的堿基序列，如seq?id?no：7-seq?id?no：8所示。

4.一種用于權(quán)利要求1所述構(gòu)建pyes2-rsnramp3、pyes2-rsnramp4、pyes2-rsnramp5重組質(zhì)粒引物對，其特點表現(xiàn)在，所述引物對的堿基序列，如seq?id?no：9-seq?id?no：14所示。

5.一種用于構(gòu)建權(quán)利要求1所述prsnramp5-gus的重組質(zhì)粒引物對，其特點表現(xiàn)在，所述引物對的堿基序列，如seq?id?no：15-seq?id?no：16所示。

6.一種用于構(gòu)建權(quán)利要求1所述rsnramp5基因過表達和抑制表達的重組質(zhì)粒引物對，其特點表現(xiàn)在，所述引物對的堿基序列，如seq?id?no：17-seq?id?no：22所示。

7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述rsnramp5基因功能驗證的方法，其特點表現(xiàn)在，通過liac-peg轉(zhuǎn)化法將pyes2-rsnramp3、pyes2-rsnramp4、pyes2-rsnramp5和pyes2空載重組至酵母感受態(tài)細胞by4741中，對酵母細胞分別進行0μm、25μm、50μm?cdcl2處理。通過異源酵母表達分析表明，rsnramp5具有轉(zhuǎn)運酵母中cd2+的能力，并促進酵母中cd2+吸收。

8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述rsnramp5基因功能驗證的方法，其特點表現(xiàn)在，將rsnramp5啟動子區(qū)域(2000bp)與pcambia1391-gus載體融合，將攜帶prorsnramp5-gus載體的根癌農(nóng)桿菌gv3101菌液注射蘿卜子葉，用50μm?cdcl2處理12h。將蘿卜子葉放置于β-葡萄糖苷酶(gus)染料中，37℃染色24h。結(jié)果表明，rsnramp5基因啟動子活性顯著受到cd誘導。

9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述rsnramp5基因功能驗證的方法，其特點表現(xiàn)在，將35s：：rsnramp5、rnai：：rsnramp5、pcambia1300空載重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌gv3101中，利用農(nóng)桿菌瞬時注射蘿卜子葉技術(shù)，將其滲透到兩周苗齡的蘿卜子葉中，使用50μm?cdcl2進行處理，以1/2?hoagland營養(yǎng)液為對照，通過對蘿卜子葉進行dab、nbt染色，以及h2o2、o2·-含量的測定，表明過表達rsnramp5可增強蘿卜子葉中cd2+吸收與ros累積。

10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述rsnramp5重金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因在育種中的應用，其特點表現(xiàn)在，所述植物為蘿卜。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種RsNRAMP5重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在蘿卜鎘吸收與活性氧累積方面的應用，包括：(1)以蘿卜cDNA為模板對RsNRAMP5進行克隆，其cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示；(2)RsNRAMP5基因表達水平受Cd處理時間(6h、12h、24h)的增加明顯上調(diào)；(3)過表達RsNRAMP5顯著增加酵母細胞Cd2+的吸收；(3)100μM?Cd處理可顯著誘導蘿卜子葉中RsNRAMP5啟動子活性；(4)利用農(nóng)桿菌注射法瞬時轉(zhuǎn)化蘿卜子葉，分析CdCl2處理下過表達與RNAi抑制表達蘿卜子葉中H2O2、O2·?和Cd含量變化，發(fā)現(xiàn)過表達RsNRAMP5促進蘿卜子葉中Cd吸收與活性氧累積。本發(fā)明為今后利用基因工程技術(shù)選育低Cd累積蘿卜種質(zhì)提供了理論依據(jù)，具有很高的應用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：徐良,馬迎菲,黃煜迪,于雯雯,柳李旺,王燕,董嘉恒
受保護的技術(shù)使用者：南京農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9