本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)和生物學(xué)，具體涉及一種臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞的擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、2010年日本科學(xué)家kuroda研究小組發(fā)現(xiàn)，在人類皮膚的真皮層和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在一類特殊的多能干細(xì)胞，這類細(xì)胞能夠表達(dá)階段特異性胚胎抗原3(anti-stagespecific?embryonic?antigen3，ssea-3)，并能承受一定程度應(yīng)激的干細(xì)胞，被命名為多系分化應(yīng)激耐受(multilineage?differentiating?stress-enduring，muse)細(xì)胞。與其他用于細(xì)胞治療的干細(xì)胞相比，haecs具有如下生物學(xué)特性，使之成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具臨床應(yīng)用潛力的種子細(xì)胞之一，muse細(xì)胞在體外不斷自我更新，可懸浮培養(yǎng)形成細(xì)胞集落；表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因(nanog、oct4、sox2、tra-1-60、ssea-3)；能夠被誘導(dǎo)分化為三胚層細(xì)胞系；在體內(nèi)可向缺損組織遷移，自發(fā)分化為缺損細(xì)胞；低端粒酶活性，不具有致瘤性，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)不形成畸胎瘤，可通過cd105、ssea-3雙陽性標(biāo)記從多種組織中分離獲得。muse細(xì)胞在組織內(nèi)含量極低，骨髓單個(gè)核細(xì)胞中muse細(xì)胞比例為0.03％，外周血單個(gè)核細(xì)胞中ssea-3陽性比例為0.04％，間充質(zhì)干細(xì)胞中muse細(xì)胞比例為1％-8.8％，因此如何獲得足量的muse細(xì)胞，成為開展臨床研究的關(guān)鍵。

2、muse細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是首次明確報(bào)道在天然單細(xì)胞水平上具有自我更新能力和多能干細(xì)胞特性的成體干細(xì)胞。muse細(xì)胞克服了escs、ipscs、nscs及其他成體定向干細(xì)胞在體內(nèi)移植治療中的許多不足之處。它具有以下特征：

3、(1)有應(yīng)激耐受力；

4、(2)表現(xiàn)為ssea-3和cd105雙陽性；

5、(3)單細(xì)胞能形成細(xì)胞球，表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物；

6、(4)可以自我更新；

7、(5)能分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞；

8、(6)在裸鼠體內(nèi)不形成畸胎瘤。

9、而現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)如下：

10、1、muse細(xì)胞通過磁珠分選后進(jìn)行培養(yǎng)。擴(kuò)增過程：細(xì)胞增殖形成細(xì)胞團(tuán)-細(xì)胞團(tuán)貼壁-細(xì)胞輻射狀貼壁-重懸形成單細(xì)胞懸液-繼續(xù)懸浮擴(kuò)增培養(yǎng)；步驟繁瑣，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

11、2、muse細(xì)胞在體外擴(kuò)增時(shí)，超過p5，細(xì)胞呈現(xiàn)緩慢增殖、細(xì)胞形態(tài)差異較大等情況，細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定。

12、故基于此，提出本發(fā)明技術(shù)方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括如下步驟：

2、(i)臍帶干細(xì)胞原代培養(yǎng)

3、(1)取臍帶進(jìn)行清理，然后剝離臍帶羊膜和動(dòng)靜脈，取出沃頓膠并進(jìn)行剪碎，再進(jìn)行培養(yǎng)，得到可傳代細(xì)胞；

4、(ii)臍帶干細(xì)胞傳代培養(yǎng)

5、(2)取可傳代的p0代細(xì)胞先進(jìn)行清洗，再加入胰蛋白酶，最后終止消化；

6、(3)終止消化后，使細(xì)胞脫落并形成單細(xì)胞懸液，然后離心；

7、(4)待離心后，棄上清液，再加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)；

8、(5)待細(xì)胞生長至融合時(shí)，重復(fù)“傳代培養(yǎng)”操作進(jìn)行擴(kuò)增，得到p5～p10代細(xì)胞；

9、(iii)臍帶muse細(xì)胞接種培養(yǎng)

10、(6)將p5～p10代細(xì)胞先接種至培養(yǎng)板中，然后貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞集落鋪展成單細(xì)胞層后，用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，得到的細(xì)胞沉淀再次懸浮培養(yǎng)，以此擴(kuò)增臍帶muse細(xì)胞。

11、為便于理解本發(fā)明，對本發(fā)明中的部分術(shù)語進(jìn)行解釋：

12、muse細(xì)胞：多系分化應(yīng)激耐受(multilineage-differentiating?stress-enduring，muse)是一種具有自我更新和多向分化潛能、可向3個(gè)胚層分化的細(xì)胞，能從皮膚、臍帶、骨髓中獲得，也可從間充質(zhì)干細(xì)胞中分離得到，有不斷自我更新能力、低端粒酶活性和非致瘤性，而且在體內(nèi)能整合到損傷部位，具有較強(qiáng)的組織修復(fù)能力，是組織工程、細(xì)胞移植及基因治療領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞。

13、優(yōu)選地，步驟(1)中，培養(yǎng)采用dmem+10％fbs完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

14、優(yōu)選地，步驟(1)中，在5％co2、溫度為37℃、濕度為95％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

15、優(yōu)選地，步驟(2)中，采用pbs緩沖液先進(jìn)行清洗，再加入0.25％胰蛋白酶，最后加入完全培養(yǎng)基終止消化。

16、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心的時(shí)間為5min，離心的溫度為室溫。

17、優(yōu)選地，步驟(4)中，加入α-mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10％fbs+1％青霉素-鏈霉素重懸細(xì)胞。

18、優(yōu)選地，步驟(6)中，貼壁培養(yǎng)的體系為：gmp級間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基+e8完全培養(yǎng)基+100μmol/ml?neaa。

19、優(yōu)選地，步驟(6)中，懸浮培養(yǎng)的體系為：gmp級間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基+e8完全培養(yǎng)基+100μmol/ml?neaa+1％甲基纖維素基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

20、本發(fā)明的有益效果為：

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明開創(chuàng)性的通過muse的培養(yǎng)配方，通過一定量的加入全能干細(xì)胞培養(yǎng)基，很好的穩(wěn)定和維持muse細(xì)胞的全能型；同時(shí)通過添加neaa等物質(zhì)，高效精準(zhǔn)的對muse細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，該方法操作步驟簡單，細(xì)胞獲取率高，提取的細(xì)胞數(shù)量足夠、細(xì)胞活率高。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間短，獲取細(xì)胞活率高，細(xì)胞數(shù)量大幅度提高。

技術(shù)特征：

1.一種臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中，培養(yǎng)采用dmem+10％fbs完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中，在5％co2、溫度為37℃、濕度為95％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，采用pbs緩沖液先進(jìn)行清洗，再加入0.25％胰蛋白酶，最后加入完全培養(yǎng)基終止消化。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心的時(shí)間為5min，離心的溫度為室溫。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中，加入α-mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10％fbs+1％青霉素-鏈霉素重懸細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(6)中，貼壁培養(yǎng)的體系為：gmp級間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基+e8完全培養(yǎng)基+100μmol/ml?neaa。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞擴(kuò)增純化的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(6)中，懸浮培養(yǎng)的體系為：gmp級間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基+e8完全培養(yǎng)基+100μmol/ml?neaa+1％甲基纖維素基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)和生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶多系分化應(yīng)激耐受細(xì)胞的擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法。所述方法包括臍帶干細(xì)胞原代培養(yǎng)、臍帶干細(xì)胞傳代培養(yǎng)和臍帶Muse細(xì)胞接種培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明開創(chuàng)性的通過Muse的培養(yǎng)配方，通過一定量的加入全能干細(xì)胞培養(yǎng)基，很好的穩(wěn)定和維持Muse細(xì)胞的全能型；同時(shí)通過添加NEAA等物質(zhì)，高效精準(zhǔn)的對Muse細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，該方法操作步驟簡單，細(xì)胞獲取率高，提取的細(xì)胞數(shù)量足夠、細(xì)胞活率高。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間短，獲取細(xì)胞活率高，細(xì)胞數(shù)量大幅度提高。

技術(shù)研發(fā)人員：盧瑞珊,李劍豪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：康研（廣州）生命科學(xué)研究有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9