本發(fā)明涉及包含與抗體輕鏈的c-末端融合的血管內皮生長因子受體(vegfr)組分的抗體融合蛋白，以及它們的制備和使用方法。

背景技術：

1、血管內皮生長因子(vegf)在血管生成中起到重要作用。vegf與其在血管內皮細胞上表達的酪氨酸激酶受體(vegfr)的結合觸發(fā)了參與血管內皮細胞增殖和新生血管生長的細胞反應。然而，vegf的過表達導致疾病。腫瘤組織趨于具有較高的vegf表達水平，這刺激腫瘤血管生成以為生長的實體腫瘤提供營養(yǎng)。血管生成還允許腫瘤與宿主的血管床接觸，這可提供腫瘤細胞轉移的途徑。vegf的過表達還可導致非腫瘤性病癥，諸如類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、血管瘤、移植的角膜組織和其他組織的免疫排斥、慢性炎癥和眼部新生血管障礙(例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶體后纖維增生癥、新生血管性青光眼和年齡相關性黃斑變性(amd))。因此，用于有效治療腫瘤性腫瘤和非腫瘤性障礙(諸如眼部新生血管障礙)的一種可能的機制是抑制或基本上降低vegf蛋白的內皮增生和血管生成活性。

2、配體與其受體之間的相互作用通常具有高親和力，從而達到納摩爾至皮摩爾的范圍。受體的細胞外結構域(ecd)或ecd的功能部分已成功用作“配體陷阱”以用于治療目的(claesson-welsh?l.,nat?med.2008年11月；14(11)：1147-1148；wiesmann?c.等人，cell.1997年11月28日；91(5):695-704；harding?tc等人，sci?transl?med.2013年3月27日；5(178):178ra39)。

3、已經開發(fā)了包含vegfr組分的重組融合蛋白來治療與vegf表達相關聯(lián)的疾病，諸如癌癥和amd。這些融合蛋白通過將vegfr片段與免疫球蛋白fc片段的n-末端或免疫球蛋白fc片段的一部分融合來產生，并且被認為是“vegf陷阱”。參見，例如us6100071、us7087411和us7521049。vegfr片段將與內源性vegf結合并且滅活內源性vegf，從而提供用于降低或抑制內源性vegf活性，并且繼而降低或抑制內皮細胞增殖和血管生成的手段。vegf陷阱(阿柏西普(aflibercept))可以比貝伐單抗(vegf中和抗體，50pm)更高的親和力(0.5pm)捕獲vegf。

4、本文提及的所有出版物、專利、專利申請和公布的專利申請的公開內容據(jù)此全文以引用方式并入本文。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及抗體融合蛋白，其包含與抗體輕鏈的c-末端(諸如，抗體輕鏈恒定結構域(cl結構域)的c-末端)融合的vegfr組分，及其制備和使用方法。

2、本技術的一個方面提供抗體融合蛋白，其包含：1)包含輕鏈的抗體，和2)vegfr組分，其中所述vegfr組分與抗體輕鏈的c-末端(諸如抗體vl-cl結構域的c-末端)融合。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含與第一抗體輕鏈的c-末端融合的第一vegfr組分，以及與第二抗體輕鏈的c-末端融合的第二vegfr組分。在一些實施方案中，第一vegfr組分和第二vegfr組分相同。在一些實施方案中，第一vegfr組分和第二vegfr組分不同。

3、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，vegfr組分包含第一vegfrflt1的免疫球蛋白樣(ig-樣)結構域2(flt1d2)。在一些實施方案中，vegfr組分還包含第二vegfr?flk1的ig-樣結構域3(flk1d3)。在一些實施方案中，vegfr組分包含seq?id?no:8的氨基酸序列。在一些實施方案中，vegfr組分還包含第三vegfr?flk1的ig-樣結構域4(flk1d4)。

4、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，vegfr組分為至少約4kda(諸如至少約下列中的任一者：4kda、8kda、12kda、17kda、20kda、25kda、27kda或30kda)。

5、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，vegfr組分和vegf之間的結合的kd為約10-8m至約10-13m(諸如約10-8m至約10-13m、約10-8m至約10-12m、約10-9m至約10-12m、約10-10m至約10-12m)。

6、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，vegfr組分和抗體輕鏈的c-末端通過接頭連接。在一些實施方案中，接頭為肽接頭，諸如包含seq?id?no:6或7的氨基酸序列的肽接頭。

7、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，抗體選自iga、igd、ige、igg、igm、igg-來源分子、fab、fab’、f(ab’)2、fab-scfv、f(ab’)2-scfv2、fab-scfv-fc、對接和鎖定(dock?and?lock)、scfv、二-scfv、雙體抗體、雙體抗體-fc、雙體抗體-ch3、和細胞內抗體。在一些實施方案中，抗體包含輕鏈恒定結構域(cl結構域)、并且vegfr組分與抗體cl結構域的c-末端(例如抗體vl-cl結構域的c-末端)融合。在一些實施方案中，抗體為全長抗體。在一些實施方案中，抗體為igg抗體，諸如igg1或igg4抗體，或其變體。

8、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，所述抗體是單特異性的。

9、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，所述抗體是多特異性的(例如，雙特異性的)。

10、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，所述抗體特異性識別免疫檢查點分子。在一些實施方案中，免疫檢查點分子是刺激性免疫檢查點分子。在一些實施方案中，免疫檢查點分子是抑制性免疫檢查點分子。在一些實施方案中，所述抑制性免疫檢查點分子選自pd-1、pd-l1、pd-l2、cd47、cxcr4、csf1r、lag-3、tim-3、hhla2、btla、ctla-4、tigit、vista、b7-h4、cd160、2b4和cd73。在一些實施方案中，抑制性免疫檢查點分子為pd-1。在一些實施方案中，所述抗體包括：包含seq?id?no:12的氨基酸序列的重鏈的重鏈-cdr1(hc-cdr1)、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:13的氨基酸序列的輕鏈的輕鏈-cdr1(lc-cdr1)、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?idno:12的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:13的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為派姆單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:12的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:14的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:15的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:16的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seqid?no:15的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:16的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為納武單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:15的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:17的氨基酸序列。在一些實施方案中，抑制性免疫檢查點分子為pd-l1。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:18的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:19的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:18的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:19的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為阿特朱單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:18的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:20的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:21的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:22的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:21的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:22的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為德瓦魯單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:21的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?idno:23的氨基酸序列。在一些實施方案中，抑制性免疫檢查點分子為ctla-4。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:9的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:10的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:9的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?idno:10的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為伊匹單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:9的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:11的氨基酸序列。

11、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，所述抗體特異性識別腫瘤抗原。在一些實施方案中，腫瘤抗原為her2。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:24的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:25的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:24的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:25的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為曲妥珠單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:24的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:26、27或28的氨基酸序列。在一些實施方案中，腫瘤抗原為egfr(her1)。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:29的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:30的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:29的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:30的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為西妥昔單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:29的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?idno:31的氨基酸序列。

12、在根據(jù)上述抗體融合蛋白中任一者的一些實施方案中，所述抗體特異性識別血管生成因子。在一些實施方案中，血管生成因子為血管生成素-2(ang2)。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:35的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:36的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:35的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?idno:36的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為尼伐單抗(nesvacumab)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:35的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:37的氨基酸序列。在一些實施方案中，血管生成因子為tnfα。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:32的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:33的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:32的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:33的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為阿達木單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:32的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:34的氨基酸序列。在一些實施方案中，血管生成因子為il-17α。在一些實施方案中，抗體包括：包含seq?id?no:38的氨基酸序列的重鏈的hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3；和/或包含seq?id?no:39的氨基酸序列的輕鏈的lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3。在一些實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:38的氨基酸序列，和輕鏈，所述輕鏈包含seq?id?no:39的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為伊克珠單抗(例如，)或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體融合蛋白包含重鏈，所述重鏈包含seq?id?no:38的氨基酸序列，和輕鏈融合多肽，所述輕鏈融合多肽包含seq?id?no:40的氨基酸序列。

13、還提供了藥物組合物，其包含上述抗體融合蛋白中的任一種和任選的藥學上可接受的載體。

14、本技術的另一方面提供了一種治療患有癌癥的個體的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的上述藥物組合物或抗體融合蛋白中的任一種。在一些實施方案中，癌癥為實體腫瘤。在一些實施方案中，癌癥為肺癌、肝癌、皮膚癌(例如，黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結直腸癌或膀胱癌。在一些實施方案中，該方法還包括使個體經受附加的癌癥治療。在一些實施方案中，藥物組合物或抗體融合蛋白全身施用，諸如靜脈內施用(i.v.)。在一些實施方案中，藥物組合物或抗體融合蛋白局部施用，諸如腫瘤內施用。在一些實施方案中，所述個體為人。

15、本技術的另一方面提供了一種治療患有非腫瘤性障礙的個體的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的上述藥物組合物或抗體融合蛋白中的任一種。在一些實施方案中，非腫瘤性障礙與vegf過表達相關聯(lián)。在一些實施方案中，非腫瘤性障礙選自類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、血管瘤、移植的角膜組織和其他組織的免疫排斥、慢性炎癥或和眼部新生血管障礙。在一些實施方案中，藥物組合物全身施用，諸如靜脈內施用(i.v.)。在一些實施方案中，非腫瘤性障礙為眼部新生血管障礙，諸如amd或糖尿病性視網(wǎng)膜病。在一些實施方案中，眼部新生血管障礙與脈絡膜新生血管形成、血管滲漏和/或視網(wǎng)膜水腫相關聯(lián)。在一些實施方案中，藥物組合物或抗體融合蛋白的施用選自滴眼液、結膜下注射、結膜下植入、玻璃體內注射、玻璃體內植入、眼球筋膜囊下注射和眼球筋膜囊下植入中的一種，諸如玻璃體內注射。在一些實施方案中，所述個體為人。

16、還提供了分離的核酸，其編碼上述抗體融合蛋白中任一種；載體，其包含上述分離的核酸中的任一種；分離的宿主細胞，其包含上述分離的核酸或載體中的任一種；試劑盒，其包含上述抗體融合蛋白、分離的核酸、載體或分離的宿主細胞中的任一種。

17、本技術的另一方面提供了一種制備上述抗體融合蛋白中的任一種的方法，所述方法包括在有效表達所編碼的抗體融合蛋白的條件下培養(yǎng)包含上述分離的核酸或載體中的任一種的宿主細胞，或培養(yǎng)上述分離的宿主細胞中的任一種；以及從所述宿主細胞獲得表達的抗體融合蛋白。在一些實施方案中，該方法還包括產生包含上述分離的核酸或載體中任一種的宿主細胞。