本發(fā)明涉及一種催化分子間c-s鍵偶聯(lián)的自給自足型p450酶及突變體的應(yīng)用，屬于酶工程及有機(jī)合成領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、在有機(jī)合成與藥物研發(fā)領(lǐng)域，分子間c-s鍵的偶聯(lián)反應(yīng)是構(gòu)建含硫有機(jī)化合物、特別是具有生物活性分子骨架的關(guān)鍵步驟。然而，傳統(tǒng)催化方法往往受限于低效率、高能耗以及產(chǎn)物選擇性差等問題，難以滿足復(fù)雜分子合成的需求。細(xì)胞色素p450酶作為自然界中一類功能多樣的生物催化劑，其獨(dú)特的催化機(jī)制和廣泛的底物適應(yīng)性為有機(jī)合成提供了新的可能。

2、然而，天然p450酶在催化分子間c-s鍵偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，常因催化活性不足、對特定底物的選擇性不高或需要額外的輔因子支持而限制了其應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中p450酶在催化c-s鍵偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)存在的催化活力不足、c-s鍵形成效率低下的問題，提供一種高效催化此類反應(yīng)、提升產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和周轉(zhuǎn)數(shù)的p450酶及全細(xì)胞催化劑。

2、本發(fā)明提供了一種p450酶突變體，是對p450酶親本的v118、c385、f424位點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得的對c-s鍵的偶聯(lián)反應(yīng)催化能力增強(qiáng)的p450酶突變體。

3、在一種實(shí)施方式中，所述p450酶突變體是在seq?id?no.1所示序列的基礎(chǔ)上，將第118位纈氨酸突變?yōu)楸彼?，并將?85位半胱氨酸突變?yōu)榻M氨酸，并將第424位苯丙氨酸突變?yōu)楦彼帷?/p>

4、在一種實(shí)施方式中，所述p450酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、本發(fā)明還提供了編碼所述p450酶突變體的基因。

6、在一種實(shí)施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

7、本發(fā)明還提供了包含所述基因的重組質(zhì)粒。

8、在一種實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒包括但不限于pet-28a(+)、pet-28b(+)或pet-20b(+)。

9、本發(fā)明還提供了攜帶所述基因或重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

10、在一種實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。

11、本發(fā)明還提供了具有p450酶突變體催化活性的細(xì)胞催化劑。

12、在一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞催化劑含有表達(dá)所述p450酶突變體的重組大腸桿菌細(xì)胞。

13、在一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌是以e.coli?bl21(de3)為宿主，以pet?28a(+)為表達(dá)載體表達(dá)所述p450酶突變體。

14、本發(fā)明還提供了制備所述細(xì)胞催化劑的方法，是將所述重組大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集具有p450酶催化活性的菌體細(xì)胞，作為全細(xì)胞催化劑。

15、本發(fā)明還提供了一種提高p450酶對芳基硫醇底物催化活力和/或周轉(zhuǎn)效率的方法，是將p450酶第118位纈氨酸突變?yōu)楸彼?、?85位半胱氨酸突變?yōu)榻M氨酸和/或?qū)⒌?24位苯丙氨酸突變?yōu)楦彼帷?/p>

16、本發(fā)明還提供了所述p450酶突變體和/或所述細(xì)胞催化劑在參與c-s鍵偶聯(lián)反應(yīng)方面的應(yīng)用。

17、有益效果：

18、(1)本發(fā)明通過定向進(jìn)化策略，成功獲得了能夠高效催化c-s鍵偶聯(lián)反應(yīng)的p450酶突變體，特別是v118a/c385h/f424p突變體，在無需額外輔因子的條件下，其催化活力相較于野生型p450酶有了顯著提升，為c-s鍵偶聯(lián)反應(yīng)提供了一種高效、可靠的催化工具。

19、(2)v118a/c385h/f424p突變體在多種芳基硫醇底物上均展現(xiàn)出了優(yōu)異的轉(zhuǎn)化率和周轉(zhuǎn)數(shù)，這不僅拓寬了p450酶的應(yīng)用范圍，也為有機(jī)合成領(lǐng)域提供了一種新的、高效的催化劑選擇。

20、(3)本發(fā)明的p450酶突變體制備方法簡單、高效，易于規(guī)?；a(chǎn)，為工業(yè)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種p450酶突變體，其特征在于，相對于p450酶親本，具有v118、c385和/或f424位點(diǎn)的突變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的p450酶突變體，其特征在于，在seq?id?no.1所示序列的基礎(chǔ)上，將第118位纈氨酸突變?yōu)楸彼?，并將?85位半胱氨酸突變?yōu)榻M氨酸，并將第424位苯丙氨酸突變?yōu)楦彼帷?/p>

3.編碼權(quán)利要求1或2所述p450酶突變體的基因。

4.含有權(quán)利要求3所述基因的重組質(zhì)粒。

5.攜帶權(quán)利要求3所述基因或權(quán)利要求4重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

6.重組大腸桿菌，其特征在于，以e.coli?bl21(de3)為宿主，以pet?28a(+)為表達(dá)載體表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的p450酶突變體。

7.細(xì)胞催化劑，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述的重組大腸桿菌細(xì)胞。

8.制備權(quán)利要求7所述細(xì)胞催化劑的方法，其特征在于，將所述重組大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集具有p450酶催化活性的菌體細(xì)胞，作為全細(xì)胞催化劑。

9.一種提高p450酶對芳基硫醇底物催化活力和/或周轉(zhuǎn)效率的方法，其特征在于，將p450酶第118位纈氨酸突變?yōu)楸彼?，將?85位半胱氨酸突變?yōu)榻M氨酸，和/或?qū)⒌?24位苯丙氨酸突變?yōu)楦彼帷?/p>

10.權(quán)利要求1或2所述的p450酶突變體，或權(quán)利要求6所述的重組大腸桿菌，或權(quán)利要求7所述的細(xì)胞催化劑在參與c-s鍵偶聯(lián)反應(yīng)方面的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種催化分子間C?S鍵偶聯(lián)的自給自足型P450酶及突變體的應(yīng)用，屬于酶工程及有機(jī)合成領(lǐng)域。本發(fā)明通過定向進(jìn)化，對P450酶的關(guān)鍵活性位點(diǎn)進(jìn)行突變，尤其是F424、V118和C385殘基。本發(fā)明構(gòu)建的突變體顯著提升了C?S鍵偶聯(lián)的活力，特別是V118A/C385H/F424P突變體在不同芳基硫醇底物上的表現(xiàn)優(yōu)異。表達(dá)突變體的微生物細(xì)胞可作為全細(xì)胞催化劑用于C?S鍵偶聯(lián)反應(yīng)，為工業(yè)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：倪曄,王彬昊,韓瑞枝,郝若楠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9