本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，尤其涉及一種近紅外光激活的蛋白臨近標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)：

1、臨近標(biāo)記技術(shù)可標(biāo)記接近目標(biāo)蛋白質(zhì)的生物分子(通常是蛋白質(zhì)或rna)。通過在活細胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)和工程標(biāo)記酶之間創(chuàng)建基因融合，生物分子在空間上接近蛋白質(zhì)。然后可以用生物素選擇性地標(biāo)記感興趣的物質(zhì)以進行下拉和分析。鄰近標(biāo)記已用于識別新型細胞結(jié)構(gòu)的成分和確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

2、現(xiàn)有的臨近標(biāo)記技術(shù)中，apex臨近標(biāo)記技術(shù)需要將細胞與雙氧水共孵育，雙氧水的毒性會導(dǎo)致該技術(shù)的生物相容性較差；bioid臨近標(biāo)記技術(shù)因其低效的酶催化活性，導(dǎo)致該技術(shù)獲得有效標(biāo)記信號所需的時間很長，因此很難對瞬時的蛋白相互作用進行有效標(biāo)記；rinid臨近標(biāo)記技術(shù)同樣是有活性氧介導(dǎo)的臨近標(biāo)記技術(shù)，但是其光敏蛋白minisog所需的光照波長位于400nm波段，這就導(dǎo)致了其較差的生物相容性以及較高的標(biāo)記信號背景。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種近紅外光激活的蛋白臨近標(biāo)記的方法。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種近紅外光激活的蛋白臨近標(biāo)記的方法，所述方法包括以下步驟：

3、(1)將dl5蛋白質(zhì)粒穩(wěn)定表達于mcf-7細胞中；

4、(2)將所述mcf-7細胞與mg2i底物以及間氨基苯乙炔共孵育，并對細胞施加660nm波段的光照；

5、所述dl5蛋白質(zhì)粒為定位于細胞核的dl5蛋白質(zhì)?；蚨ㄎ挥诰€粒體的dl5蛋白質(zhì)粒，所述定位于細胞核的dl5蛋白質(zhì)粒的dna序列如seq?id?no.1所示，所述定位于線粒體的dl5蛋白質(zhì)粒的dna序列如seq?id?no.2所示；

6、所述mg2i底物具有以下式ⅰ的結(jié)構(gòu)式；

7、

8、上述的方法，進一步的，所述mg2i底物采用包括以下步驟的方法制備得到：

9、s1、將3,5-二碘-4-羥基苯甲醛、4-溴丁酸乙酯、碳酸鉀溶于有機溶液中，加熱反應(yīng)得到化合物a；

10、s2、將所述化合物a，n,n-二甲基苯胺，氯化鋅溶于無水乙醇中，加熱反應(yīng)得到化合物b；

11、s3、將所述化合物b，四氯苯醌溶于乙腈，加熱反應(yīng)得到mg2i；

12、所述化合物a具有以下式ⅱ的結(jié)構(gòu)式：

13、

14、所述化合物b具有以下式ⅱ的結(jié)構(gòu)式：

15、

16、上述的方法，進一步的，所述s1中所述3,5-二碘-4-羥基苯甲醛、4-溴丁酸乙酯、碳酸鉀的摩爾濃度比為：1﹕1.2﹕1；

17、和/或，所述有機溶液為dmf；

18、和/或，所述攪拌反應(yīng)具體為：90℃攪拌反應(yīng)3～6小時。

19、上述的方法，進一步的，所述s2中所述化合物a，n,n-二甲基苯胺，氯化鋅的摩爾濃度比為：1﹕2﹕1；

20、和/或，所述攪拌反應(yīng)具體為：80℃反應(yīng)24～48小時。

21、上述的方法，進一步的，所述s3中化合物b和四氯苯醌的摩爾濃度比為：1﹕1；

22、和/或，所述攪拌反應(yīng)具體為：80℃反應(yīng)3～6小時。

23、上述的方法，進一步的，所述(1)具體為：將所述dl5蛋白質(zhì)粒與pax、pmd、p3000進行混合包裝獲得慢病毒；用所述慢病毒感染mcf-7細胞。

24、上述的方法，進一步的，所述(2)具體為：將500nmol/l?mg2i以及1mmol/l間氨基苯乙炔與mcf-7細胞孵育一小時；對mcf-7細胞施加660nm波段的光照20分鐘。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

26、(1)提供了一種由近紅外光激活的臨近標(biāo)記方法：fap-tap，由熒光激活蛋白dl5和特異性與其結(jié)合的底物mg2i組成。fap-tap介導(dǎo)的臨近標(biāo)記技術(shù)能有效解決當(dāng)前臨近標(biāo)記技術(shù)中存在的生物相容性差、標(biāo)記時間長、標(biāo)記背景過高的問題。在660nm的近紅外光照射下，能快速高效地產(chǎn)生單線態(tài)氧。其產(chǎn)生的單線態(tài)氧能氧化臨近蛋白的組氨酸殘基，這就使得一些胺類蛋白標(biāo)記探針能與被氧化的組氨酸殘基進行共價反應(yīng)，實現(xiàn)臨近蛋白標(biāo)記。綜上，fap-tap介導(dǎo)的臨近標(biāo)記技術(shù)能有效解決當(dāng)前臨近標(biāo)記技術(shù)中存在的生物相容性差、標(biāo)記時間長、標(biāo)記背景過高的問題。

技術(shù)特征：

1.一種近紅外光激活的蛋白臨近標(biāo)記的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述mg2i底物采用包括以下步驟的方法制備得到：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述s1中所述3,5-二碘-4-羥基苯甲醛、4-溴丁酸乙酯、碳酸鉀的摩爾濃度比為：1﹕1.2﹕1；

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述s2中所述化合物a，n,n-二甲基苯胺，氯化鋅的摩爾濃度比為：1﹕2﹕1；

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述s3中化合物b和四氯苯醌的摩爾濃度比為：1﹕1；

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述(1)具體為：將所述dl5蛋白質(zhì)粒與pax、pmd、p3000進行混合包裝獲得慢病毒；用所述慢病毒感染mcf-7細胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述(2)具體為：將500nmol/lmg2i以及1mmol/l間氨基苯乙炔與mcf-7細胞孵育一小時；對mcf-7細胞施加660nm波段的光照20分鐘。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種近紅外光激活的蛋白臨近標(biāo)記的方法，包括：將dL5蛋白質(zhì)粒穩(wěn)定表達于MCF?7細胞中；將MCF?7細胞與MG2I底物以及間氨基苯乙炔共孵育，并對細胞施加660nm波段的光照；dL5蛋白質(zhì)粒為定位于細胞核的dL5蛋白質(zhì)粒或定位于線粒體的dL5蛋白質(zhì)粒。本發(fā)明通過熒光激活蛋白dL5和特異性與其結(jié)合的底物MG2I介導(dǎo)的臨近標(biāo)記技術(shù)能有效解決當(dāng)前臨近標(biāo)記技術(shù)中存在的生物相容性差、標(biāo)記時間長、標(biāo)記背景過高的問題。

技術(shù)研發(fā)人員：蔣健暉,賀建軍,任天鈺
受保護的技術(shù)使用者：湖南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9