本發(fā)明涉及單細(xì)胞測序，特別涉及用于細(xì)胞體外培養(yǎng)批量標(biāo)記及動態(tài)譜系追蹤的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)序列標(biāo)簽方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞異質(zhì)性是指在同一種來源組織中存在不同類型的細(xì)胞，它們在形態(tài)、功能和基因表達(dá)等方面有所不同。以腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性為例，這種異質(zhì)性可能導(dǎo)致腫瘤的治療效果不佳，因?yàn)椴煌愋偷哪[瘤細(xì)胞對治療藥物的敏感性不同，甚至可能會導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展使得研究人員可以更加深入地了解同種組織中不同細(xì)胞類型的特征和功能。通過單細(xì)胞測序，可以揭示細(xì)胞群體中的亞群，并分析它們在基因表達(dá)水平上的差異。研究人員關(guān)注腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化和突變過程，探索不同腫瘤細(xì)胞類型之間的關(guān)系，以及它們是如何形成和演變的。這有助于理解腫瘤的異質(zhì)性來源，并為開發(fā)更有效的治療策略提供依據(jù)。當(dāng)前，10x?genomics的chromium單細(xì)胞測序平臺以及indrop的drop-seq單細(xì)胞測序平臺等利用微流控芯片技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并在測序后根據(jù)dna條形碼序列對細(xì)胞進(jìn)行分選。但這樣的標(biāo)記是橫斷面的，不能追蹤其后代的命運(yùn)。要實(shí)現(xiàn)在不同時間點(diǎn)進(jìn)行測序，來追蹤細(xì)胞的分化和遷移過程，需要利用數(shù)學(xué)模型和計算算法推斷腫瘤細(xì)胞的譜系關(guān)系。常見的方法包括構(gòu)建進(jìn)化樹、分析突變共現(xiàn)模式、計算細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)移概率等。

2、因此，需要開發(fā)一種能夠快速方便地對細(xì)胞進(jìn)行追蹤的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸與方法，在體外培養(yǎng)中批量標(biāo)記細(xì)胞，使每個細(xì)胞都具有唯一的rna條形碼，從而可以對細(xì)胞進(jìn)行追蹤，并且針對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)特別優(yōu)化，使得其在后續(xù)單細(xì)胞測序中能準(zhǔn)確測出。

2、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述寡核苷酸從5’端到3’端依次包括：

4、引物1、條形碼、引物2、poly?a尾和加尾信號，所述引物1、引物2的核苷酸序列依次為seq?id?no.2-seq?id?no.3所示，所述條形碼由10個隨機(jī)堿基組成。

5、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有所述的用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸。

6、在本發(fā)明的第三方面，提供了所述的用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所述方法包括：

7、合成獲得所述的用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸；

8、對所述寡核苷酸pcr擴(kuò)增，獲得pcr產(chǎn)物；

9、將所述pcr產(chǎn)物連接入表達(dá)載體，獲得用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的表達(dá)載體。

10、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的方法，所述方法包括：

11、將所述的用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)體外培養(yǎng)的細(xì)胞中。

12、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法，所述方法包括：

13、先采用所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，獲得標(biāo)記后的單細(xì)胞；

14、對所述標(biāo)記后的單細(xì)胞依序進(jìn)行細(xì)胞裂解提取獲得rna、使用逆轉(zhuǎn)錄酶將所述rna轉(zhuǎn)錄為cdna、對所述cdna進(jìn)行文庫構(gòu)建，獲得可直接用于后續(xù)測序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫。

15、在本發(fā)明的第六方面，提供了所述方法制備得到的高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫。

16、在本發(fā)明的第七方面，提供了所述的高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫在單細(xì)胞測序中的應(yīng)用。

17、在本發(fā)明的第八方面，提供了所述的高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫在單細(xì)胞測序中的應(yīng)用。

18、在本發(fā)明的第九方面，提供了.一種高通量的單細(xì)胞測序方法，所述方法包括采用所述的高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫，后采用高通量測序平臺進(jìn)行測序。

19、本發(fā)明實(shí)施例中的一個或多個技術(shù)方案，至少具有如下技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

20、1、本發(fā)明提供的用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸與方法，用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸能夠在人體外培養(yǎng)細(xì)胞中正常表達(dá)，產(chǎn)物無對于的翻譯多肽或蛋白，對正常的細(xì)胞活動無影響。用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸中的引物1和引物2與人基因組中的序列無匹配，因此，通過pcr可以簡單快速的驗(yàn)證文庫表達(dá)情況。

21、與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

22、(1)精確的細(xì)胞追蹤：適用于3’端建庫的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，能夠被單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序讀取，通過引物序列確認(rèn)文庫，通過條形碼區(qū)域?qū)崿F(xiàn)唯一性，及通過條形碼的組合追蹤細(xì)胞譜系變化。

23、(2)高通量標(biāo)記：10位隨機(jī)序列，理論上可產(chǎn)生410＝1048576個唯一條碼，在轉(zhuǎn)染中，還可以通過條形碼的組合，實(shí)現(xiàn)更高的標(biāo)記通量。

24、(3)表達(dá)高效率，讀長高覆蓋：文庫全程在100bp以內(nèi)，表達(dá)效率高，序列與人類基因組無匹配，對基因組無干擾，不表達(dá)多肽及蛋白。全長控制在100bp內(nèi)，保證了后續(xù)轉(zhuǎn)錄組單細(xì)胞測序建庫中捕獲文庫序列。

25、(4)操作簡便，易于實(shí)施：無需抗性篩選等繁瑣步驟，對目的實(shí)驗(yàn)過程無干擾。

26、2、細(xì)胞譜系追蹤和表達(dá)標(biāo)簽的結(jié)合在生物學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價值。通過這種技術(shù)，研究者可以追蹤特定細(xì)胞群體的發(fā)育過程或者在生理?xiàng)l件下的行為。這些標(biāo)簽?zāi)軌驇椭茖W(xué)家們解決多種生物學(xué)問題，包括：發(fā)育生物學(xué)：了解不同細(xì)胞類型的起源及其發(fā)展過程，揭示細(xì)胞命運(yùn)決定的機(jī)制。組織再生與修復(fù)：研究特定細(xì)胞在損傷后的反應(yīng)及其在組織修復(fù)中的作用。腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移：追蹤腫瘤細(xì)胞的來源和轉(zhuǎn)移過程，幫助闡明腫瘤的異質(zhì)性和耐藥性機(jī)制。神經(jīng)科學(xué)：揭示神經(jīng)元的連接方式及其在認(rèn)知和行為功能中的作用。藥物開發(fā)：評估藥物對特定細(xì)胞類型或組織的作用，優(yōu)化治療策略?；蚓庉嬇c基因治療：確定特定基因編輯或基因治療策略在細(xì)胞和組織水平的效果和安全性?？傊?，細(xì)胞譜系追蹤表達(dá)標(biāo)簽的應(yīng)用為理解生物體內(nèi)復(fù)雜細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能提供了強(qiáng)大的工具，推動了多個領(lǐng)域的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用的發(fā)展。

技術(shù)特征：

1.一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述寡核苷酸從5’端到3’端依次包括：

2.一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸。

3.一種權(quán)利要求2所述的用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

4.一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的方法，其特征在于，所述方法包括：

5.一種高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

6.一種采用權(quán)利要求5所述方法制備得到的高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫。

7.權(quán)利要求6所述的高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫在單細(xì)胞測序中的應(yīng)用。

8.一種高通量的單細(xì)胞測序方法，其特征在于，所述方法包括采用權(quán)利要求6所述的高通量的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫，后采用高通量測序平臺進(jìn)行測序。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸和方法，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述寡核苷酸從5’端到3’端依次包括：引物1、條形碼、引物2、Poly?A尾和加尾信號，所述引物1、引物2的核苷酸序列依次為SEQ?ID?NO.2?SEQ?ID?NO.3所示，所述條形碼由10個隨機(jī)堿基組成。用于對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸中的引物1和引物2與人基因組中的序列無匹配，因此，通過PCR可簡單快速的驗(yàn)證文庫表達(dá)情況，本發(fā)明在體外培養(yǎng)中批量標(biāo)記細(xì)胞，使每個細(xì)胞都具有唯一的RNA條形碼，從而可以對細(xì)胞進(jìn)行追蹤，并且針對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)特別優(yōu)化，使得其在后續(xù)單細(xì)胞測序中能準(zhǔn)確測出。

技術(shù)研發(fā)人員：李源,肖祝雅,張道明,伍龍,趙辭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢大學(xué)人民醫(yī)院（湖北省人民醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9