本發(fā)明涉及細(xì)胞模型，尤其涉及一種肝細(xì)胞損傷模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肝臟作為體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性器官，具有解毒、消化、免疫和代謝等多種功能，功能障礙直接導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。糖脂代謝紊亂引起的代謝紊亂相關(guān)脂肪性肝病日益嚴(yán)重。代謝紊亂相關(guān)脂肪性肝病顯著增加了2型糖尿病和心血管疾病發(fā)生及致死概率，然而至今尚無批準(zhǔn)用于其治療的藥物。代謝紊亂相關(guān)脂肪性肝病從單純的肝脂肪變性發(fā)展成更具危害的代謝紊亂相關(guān)脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化是遺傳易感、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和腸道菌群紊亂等“多重打擊”的結(jié)果，其中，脂代謝紊亂引起的肝細(xì)胞損傷是病理進(jìn)程級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2、磷酸乙醇胺磷酸酶etnppl基因又名丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2類似物1agxt2l1，該基因編碼的磷酸乙醇胺磷酸酶能將磷酸乙醇胺petn不可逆地分解為無機(jī)磷酸鹽、氨和乙醛，并且etnppl對(duì)petn的水解具有高度的特異性。petn是cdp-乙醇胺（肯尼迪）途徑中磷脂酰乙醇胺合成的前體。此外，petn還被視為線粒體呼吸的潛在抑制劑。乙醛主要在肝臟中進(jìn)行代謝且具有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致肝脂肪變性、炎癥、氧化應(yīng)激和其他損傷。

3、etnppl在大腦和肝臟中大量表達(dá)，其異常表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟疾病有關(guān)。最近的一項(xiàng)研究表明，etnppl的表達(dá)在小鼠大腦早期發(fā)育過程中急劇增加，并且etnppl的缺失會(huì)改變小鼠大腦的磷脂譜，表明etnppl可以調(diào)節(jié)腦脂質(zhì)代謝。在idh1突變的膠質(zhì)瘤中，etnppl的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)etnppl可以減少膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)，這表明etnppl可以抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生。etnppl在精神分裂癥和躁狂癥患者的大腦中顯著上調(diào)，這可能是神經(jīng)化學(xué)失衡的一種代償反應(yīng)。在肝癌組織和細(xì)胞中，etnppl的低表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，而etnppl的過表達(dá)可抑制肝細(xì)胞癌（hepatocellular?carcinoma，hcc）的遷移和侵襲，這表明etnppl可作為hcc的治療靶點(diǎn)。etnppl在hcc組織的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，用sirna沉默etnppl的表達(dá)可促進(jìn)97h和lm3這兩種肝癌細(xì)胞的脂肪生成。在胰島素抵抗的hepg2細(xì)胞中，etnppl表達(dá)上調(diào)，沉默etnppl可改善hepg2細(xì)胞的胰島素抵抗。此外，過表達(dá)etnppl可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞的胰島素抵抗、活性氧（ros）生成和pi3k/akt通路失活，進(jìn)而使hepg2細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗。另有研究表明，過表達(dá)etnppl還能促進(jìn)精氨酸酶（arg2）的活化，揭示了etnppl可通過調(diào)節(jié)hepg2細(xì)胞中的arg2-ros信號(hào)軸進(jìn)而抑制自噬。

4、目前少有通過基因編輯構(gòu)建肝細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型的報(bào)道，開發(fā)肝細(xì)胞損傷模型對(duì)于肝細(xì)胞損傷分子機(jī)制解析和靶向治療措施評(píng)價(jià)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種肝細(xì)胞損傷模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

2、具體地，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

3、第一方面，本發(fā)明提供一種肝細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建方法，所述方法包括：對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，以使得所述肝細(xì)胞中etnppl蛋白的含量和/或活性提高。

4、雖然目前已知多個(gè)信號(hào)通路和基因參與肝細(xì)胞代謝和功能發(fā)揮，但是，目前仍少有通過簡(jiǎn)單的基因編輯即獲得肝細(xì)胞損傷模型的研究報(bào)道。本發(fā)明在研發(fā)過程中意外地發(fā)現(xiàn)，提高肝細(xì)胞中etnppl蛋白的含量和/或活性能夠?qū)е赂渭?xì)胞功能損傷，并同時(shí)在還原型谷胱甘肽(gsh)、活性氧(ros)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)等生理生化指標(biāo)、線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量、細(xì)胞增殖能力、以及肝細(xì)胞增殖存活、能量代謝、葡萄糖攝取和胰島素信號(hào)的關(guān)鍵信號(hào)通路等方面均表現(xiàn)出異常，特別適用于作為肝細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建。與以往的單基因編輯僅會(huì)導(dǎo)致個(gè)別生理生化指標(biāo)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等異常相比，etnppl單基因編輯即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)關(guān)鍵生理生化指標(biāo)的改變以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信號(hào)通路異常，可實(shí)現(xiàn)高效構(gòu)建肝細(xì)胞損傷模型。

5、本發(fā)明中，所述etnppl蛋白的含量提高通過以下1）和/或2）實(shí)現(xiàn)：

6、1）增加etnppl基因的拷貝數(shù)；

7、2）增強(qiáng)etnppl基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控元件的活性。

8、本發(fā)明中，etnppl即磷酸乙醇胺磷酸酶，該蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。etnppl基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

9、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述etnppl蛋白的含量提高通過增加etnppl基因的拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)。

10、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，所述etnppl蛋白的含量提高通過在所述肝細(xì)胞的基因組中插入etnppl基因的表達(dá)盒實(shí)現(xiàn)。

11、優(yōu)選地，所述etnppl基因的表達(dá)盒包含kozak序列和etnppl基因。所述kozak序列為gccacc。

12、優(yōu)選地，在肝細(xì)胞的基因組中插入etnppl基因的表達(dá)盒可利用整合型質(zhì)粒（例如piggybac過表達(dá)載體以及4pb輔助載體）實(shí)現(xiàn)。

13、本發(fā)明中，所述肝細(xì)胞為人正常肝細(xì)胞。

14、優(yōu)選地，所述肝細(xì)胞為l02肝細(xì)胞。

15、l02細(xì)胞是一種人類肝細(xì)胞，來源于健康人體的肝組織，具有較高的增殖能力，能夠在培養(yǎng)基中持續(xù)生長(zhǎng)和繁殖，保持了肝細(xì)胞合成蛋白質(zhì)、分解有毒物質(zhì)等多種功能。本發(fā)明構(gòu)建了etnppl基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的l02細(xì)胞，該細(xì)胞中etnppl基因的表達(dá)量顯著提高；通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在l02細(xì)胞中過表達(dá)etnppl基因?qū)е赂渭?xì)胞代謝功能受損，可用于構(gòu)建肝細(xì)胞損傷模型。

16、第二方面，本發(fā)明提供以上所述的方法構(gòu)建得到的肝細(xì)胞損傷模型。

17、優(yōu)選地，所述肝細(xì)胞損傷模型為過表達(dá)etnppl基因的l02肝細(xì)胞。

18、第三方面，本發(fā)明提供以上所述的肝細(xì)胞損傷模型在篩選用于預(yù)防和/或治療肝細(xì)胞損傷的藥物中的應(yīng)用。

19、第四方面，本發(fā)明提供以上所述的肝細(xì)胞損傷模型在分析肝細(xì)胞損傷分子機(jī)制中的應(yīng)用。

20、第五方面，本發(fā)明提供etnppl蛋白或其編碼基因在肝細(xì)胞損傷模型構(gòu)建中的應(yīng)用。

21、第六方面，本發(fā)明提供etnppl蛋白或其編碼基因或者etnppl蛋白或其編碼基因的激活劑在制備用于降低肝細(xì)胞抗氧化能力、減少肝細(xì)胞線粒體數(shù)量、破壞肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和/或抑制肝細(xì)胞信號(hào)通路pi3k/akt活化的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

22、上述應(yīng)用中，etnppl蛋白或其編碼基因的激活劑為能夠提高etnppl蛋白或其編碼基因的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)，包括但不限于化合物、組合物、蛋白或核酸。

23、本發(fā)明的有益效果至少包括：本發(fā)明提供一種過表達(dá)磷酸乙醇胺磷酸酶基因etnppl損傷肝細(xì)胞功能的模型，etnppl在肝細(xì)胞中過表達(dá)后，還原型谷胱甘肽(gsh)降低，活性氧(ros)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)升高；線粒體空泡化和結(jié)構(gòu)受損，線粒體數(shù)量減少，細(xì)胞增殖能力下降；肝細(xì)胞增殖存活、能量代謝、葡萄糖攝取和胰島素信號(hào)的關(guān)鍵信號(hào)通路pi3k/akt的akt磷酸化位點(diǎn)p-akt-thr308和p-akt-ser473蛋白表達(dá)量降低。該過表達(dá)etnppl的肝細(xì)胞可作為肝細(xì)胞代謝功能受損模型，用于肝細(xì)胞損傷分子機(jī)制解析和作為靶向治療措施評(píng)價(jià)的材料。