本技術(shù)涉及多肽化學(xué)合成，特別是涉及一種固相多肽合成的方法和裝置。

背景技術(shù)：

1、流動化學(xué)(flow?chemistry)，又被稱為連續(xù)流動化學(xué)，指化學(xué)反應(yīng)試劑的添加、混合、反應(yīng)、分離純化等步驟在連續(xù)流動的系統(tǒng)中完成；試劑添加、混合、反應(yīng)、分離純化等是連續(xù)進(jìn)行的，是區(qū)別傳統(tǒng)批次化學(xué)(batch?chemistry)的一種合成技術(shù)。流動化學(xué)通常使用微通道芯片、線圈、填充床等作為反應(yīng)器。

2、填充床反應(yīng)器(packed?bed?reactor，pbr)，又稱固定床反應(yīng)器，是流動化學(xué)技術(shù)中的一類重要反應(yīng)器。這類反應(yīng)器通常將固相不溶組分填充于反應(yīng)器內(nèi)，并用篩板封裝；然后連續(xù)通入其它反應(yīng)組分溶液，使其它反應(yīng)組分溶液連續(xù)通過填充固相組分，并在一定反應(yīng)條件下實(shí)現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)。

3、多肽是生物體內(nèi)一類重要的活性物質(zhì)，是由兩個或兩個以上氨基酸通過肽鍵共價(jià)連接形成的聚合物。多肽的合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值。大部分多肽分子都是通過化學(xué)合成獲取的，并且應(yīng)用最多的是固相合成方法，即固相多肽合成(solid?phase?peptide?synthesis，簡寫為spps)。

4、固相多肽合成是由美國科學(xué)家bruce?merrifield于1963年首次提出的多肽合成方法。這種方法首先采用一個適合的固相載體，通常是一種樹脂，并將第一個氨基酸固定在載體上；然后脫去保護(hù)基團(tuán)，將下一個保護(hù)氨基酸與第一個氨基酸的殘基反應(yīng)并形成肽鍵；再然后脫去第二個氨基酸的保護(hù)基團(tuán)，再連接下一個氨基酸，通過上述循環(huán)重復(fù)操作，使肽鏈增長以達(dá)到所需的肽鏈長度；最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，分離純化，獲得目標(biāo)多肽。

5、固相多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從c端向n端合成。因此，固相多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，一般遵循縮合-洗滌-去保護(hù)-洗滌-下一輪縮合的重復(fù)操作。合成多肽的過程中，每增加一個氨基酸需要4步：第一步縮合，向末端裸露氨基的樹脂中添加縮合試劑、帶保護(hù)氨基酸和堿，使樹脂末端的氨基和帶保護(hù)氨基酸的羧基行成肽鍵；第二步清洗，向縮合后的反應(yīng)體系里多次加入溶劑，并過濾，除去樹脂以外的殘留試劑；第三步脫保護(hù)，向樹脂中加入脫保護(hù)試劑，去除末端氨基的保護(hù)基，以便進(jìn)行下一個氨基酸的縮合反應(yīng)；第四步清洗，向反應(yīng)體系中多次加入溶劑，并過濾，除去樹脂以外的殘留試劑。

6、由于合成過程存在大量的重復(fù)操作，會耗費(fèi)大量的人力和時間，合成工作者希望利用自動化儀器代替人工操作以節(jié)約人力時間成本，即多肽合成儀。多肽合成儀經(jīng)過了數(shù)十年的發(fā)展，目前應(yīng)用最廣泛的第三代多肽合成儀，無死角多肽合成儀。

7、但是，無論是人工的固相多肽合成，還是多肽合成儀；都存在難以克服的缺陷，即在合成多肽的四步反應(yīng)中，第一步縮合和第三步脫保護(hù)的反應(yīng)效率較低，需要較長的反應(yīng)時間，通常都在半小時以上；并且，氨基酸縮合和脫保護(hù)反應(yīng)不徹底，每接上一個氨基酸的平均產(chǎn)率較低，導(dǎo)致合成多肽產(chǎn)物純度較低。

8、因此，如何提高固相多肽合成的反應(yīng)效率和產(chǎn)率，仍然是固體多肽合成技術(shù)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的是提供一種改進(jìn)的固相多肽合成的方法和裝置。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采用了以下技術(shù)方案：

3、本技術(shù)的一方面公開了一種固相多肽合成的方法，包括將填充有多肽合成的固相載體的填充床反應(yīng)器放置于液體介質(zhì)中，對液體介質(zhì)進(jìn)行控溫，并施加超聲波場；在控溫和超聲波場條件下，采用連續(xù)注液的方式，向填充床反應(yīng)器內(nèi)依序注入用于多肽合成的試劑，進(jìn)行連續(xù)的固相多肽合成。

4、可以理解，本技術(shù)的關(guān)鍵在于多肽的固相合成，至于多肽合成后，將其從固相載體上切割下來的方式，可以參考現(xiàn)有技術(shù)。本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，完成最后一個氨基酸的偶聯(lián)后，采用tfa在常溫下將肽鏈從固相載體上裂解下來，獲得多肽溶液；然后，對多肽溶液進(jìn)行濃縮，獲得濃縮液，將濃縮液滴入冰乙醚中得到懸濁液，對懸濁液進(jìn)行離心獲得沉淀，即獲得多肽。

5、需要說明的是，本技術(shù)的固相多肽合成方法，采用流動化學(xué)的連續(xù)注液方式進(jìn)行固相多肽合成，并且，整個反應(yīng)過程在超聲波場輔助和溫控下進(jìn)行，有效的提高多肽合成的速度，例如本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，使多肽縮合反應(yīng)時間縮短至2分鐘以內(nèi)，氨基酸脫保護(hù)時間縮短至3分鐘以內(nèi)，比現(xiàn)有的相同規(guī)格的固相多肽合成方法快10倍以上，提高了多肽固相合成的生產(chǎn)效率。并且，通過超聲波場輔助多肽合成，還有效的提高了多肽合成反應(yīng)傳質(zhì)傳熱效率，提高了目標(biāo)多肽的純度，提高了每個氨基酸的平均偶聯(lián)產(chǎn)率，例如本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，每個氨基酸的平均偶聯(lián)產(chǎn)率可以高達(dá)99％以上。

6、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，填充床反應(yīng)器具有中空腔體，中空腔體兩端分別設(shè)置有溶液入口和溶液出口，在溶液入口和溶液出口分別放置5-50μm孔徑的篩板，兩端篩板之間的空腔裝填多肽合成的固相載體。

7、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，超聲波場的超聲波頻率為25khz-80khz。例如，具體的超聲波頻率可以為25khz、30khz、35khz、40khz、45khz、50khz、55khz、60khz、65khz、70khz、75khz或80khz；具體的可以根據(jù)反應(yīng)條件和填充床反應(yīng)器的規(guī)格而定。

8、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，超聲波場的超聲波頻率優(yōu)選為30-50khz。

9、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，超聲波場的功率密度為0.5-5.0w/cm2。

10、需要說明的是，本技術(shù)的固相多肽合成方法中，超聲波場的功率密度不能太高也不能太低，超聲波場的功率密度太低，例如低于0.5w/cm2，則輔助提高反應(yīng)速度的效果較差；超聲波場的功率密度太高，例如高于5.0w/cm2，則能耗大，且對裝置的損耗也大。因此，優(yōu)選地超聲波場的功率密度為0.5-5.0w/cm2，且超聲波場的超聲波頻率優(yōu)選為30-50khz。

11、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，液體介質(zhì)為水。

12、需要說明的是，液體介質(zhì)的作用主要是進(jìn)行控溫和超聲波場的傳導(dǎo)，水只是一種比較安全、廉價(jià)且易獲取的液體介質(zhì)，不排除還可以采用其他液體介質(zhì)。

13、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，恒溫的溫度為40-95℃。例如，恒溫控制的溫度可以為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃。

14、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，控溫溫度優(yōu)選為55-95℃，更優(yōu)選為65-85℃。

15、需要說明的是，對于固相多肽合成，一般認(rèn)為，提高反應(yīng)溫度可以加快反應(yīng)速度，但反應(yīng)溫度太高容易產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物；因此，比較保守和安全的固相多肽合成溫度為20-35℃。但是，本技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，采用流動化學(xué)進(jìn)行固相多肽合成時，控制恒溫?zé)嵩〉臏囟葹?0-95℃，優(yōu)選為55-95℃，更優(yōu)選為65-85℃，并輔助超聲波場，既能夠提高反應(yīng)速度，又能夠確保每個氨基酸的平均偶聯(lián)產(chǎn)率，提高目標(biāo)多肽的純度。

16、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，控溫允許的溫度波動范圍為±2℃，優(yōu)選為±1.5℃，更優(yōu)選為±1℃。

17、需要說明的是，控溫允許的溫度波動是指，在進(jìn)行恒溫?zé)嵩r，雖然理論上設(shè)置為恒溫條件，但是，實(shí)際上允許熱浴溫度在該設(shè)置溫度上有一定的波動。本技術(shù)的固相多肽合成方法中，溫度波動范圍在±2℃都能夠滿足使用需求；當(dāng)然，更優(yōu)的溫度波動范圍為±1.5℃，更優(yōu)選為±1℃，溫度波動范圍越小，對裝置的要求越高，相應(yīng)的對反應(yīng)的控制也更準(zhǔn)確。

18、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，連續(xù)注液的方式包括依次不間斷的向填充床反應(yīng)器中循環(huán)注入試劑，同時，試劑連續(xù)從填充床反應(yīng)器的溶液出口排出。

19、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，多肽合成的試劑包括偶聯(lián)試劑、清洗試劑和脫保護(hù)試劑。

20、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，向填充床反應(yīng)器內(nèi)依序注入用于多肽合成的試劑，具體包括，不間斷的向填充床反應(yīng)器中按照偶聯(lián)試劑、清洗試劑、脫保護(hù)試劑、清洗試劑的順序連續(xù)循環(huán)注入試劑。

21、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，偶聯(lián)試劑以1-5ml/min的流速持續(xù)注入填充床反應(yīng)器內(nèi)。

22、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，持續(xù)注入偶聯(lián)試劑的時間為0.5-10分鐘。

23、需要說明的是，持續(xù)注入偶聯(lián)試劑的時間，實(shí)際上就是氨基酸縮合的時間，采用本技術(shù)的固相多肽合成方法，該時間僅僅只需要0.5-10分鐘即可，其時間長短主要取決于合成多肽的量，例如對于合成0.1毫摩爾多肽，通常只需要3分鐘即可，合成多肽的量越大所需時間越長。但是，總的來說，對于相同規(guī)格的多肽而言，例如對于同樣是合成0.1毫摩爾多肽的規(guī)格，本技術(shù)方法只需要3分鐘即可完成氨基酸縮合，而現(xiàn)有方法通常需要更長的時間，甚至有的反應(yīng)需要半小時以上。

24、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，脫保護(hù)試劑以1-5ml/min的流速持續(xù)注入填充床反應(yīng)器內(nèi)。

25、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，持續(xù)注入脫保護(hù)試劑的時間為0.5-10分鐘。

26、需要說明的是，持續(xù)注入脫保護(hù)試劑的時間，實(shí)際上就是樹脂或氨基酸脫保護(hù)的時間，采用本技術(shù)的固相多肽合成方法，該時間僅僅只需要0.5-10分鐘即可，其時間長短主要取決于合成多肽的量，例如對于合成0.1毫摩爾多肽，通常只需要2分鐘即可，合成多肽的量越大所需時間越長。但是，總的來說，對于相同規(guī)格的多肽而言，例如對于同樣是合成0.1毫摩爾多肽，本技術(shù)方法只需要2分鐘即可完成脫保護(hù)反應(yīng)，而現(xiàn)有方法通常需要更長時間，有的甚至需要半小時以上。

27、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，清洗試劑以10-100ml/min的流速持續(xù)注入填充床反應(yīng)器內(nèi)。

28、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，偶聯(lián)試劑含有氨基酸、縮合試劑、堿和溶劑；其中，氨基酸的用量為2-8當(dāng)量，堿的用量為2-8當(dāng)量，并且每個循環(huán)按照合成多肽的氨基酸順序替換偶聯(lián)試劑中的氨基酸。

29、需要說明的是，現(xiàn)有技術(shù)中，為了確保合成速度和目標(biāo)多肽的產(chǎn)率，通常需要采用更高當(dāng)量的氨基酸，例如采用10當(dāng)量甚至更高當(dāng)量的氨基酸；本技術(shù)的方法，通過設(shè)計(jì)的填充床反應(yīng)器，在超聲波場輔助和恒溫40-95℃，優(yōu)選為55-95℃，更優(yōu)選為65-85℃，能夠?qū)崿F(xiàn)在確保目標(biāo)多肽產(chǎn)率的情況下，采用更低當(dāng)量的氨基酸。這樣不僅能夠有效的降低原材料成本，也能夠降低副產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高目標(biāo)多肽的純度。

30、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，偶聯(lián)試劑中的堿為diea、dipea、nmm、et3n、dbu中的至少一種。

31、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，脫保護(hù)試劑含有堿和溶劑，其中，堿的用量為4-20當(dāng)量。

32、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，脫保護(hù)試劑中的堿為哌啶、乙二胺、環(huán)己胺、嗎菲林、dbu中的至少一種。

33、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，清洗試劑為dcm、dmf、dmso、nmp、thf、py中的至少一種；偶聯(lián)試劑和脫保護(hù)試劑中的溶劑為dcm、dmf、dmso、nmp、thf、py中的至少一種。

34、需要說明的是，本技術(shù)的關(guān)鍵在于，填充床反應(yīng)器的設(shè)計(jì)以及超聲波場輔助和恒溫控制，至于偶聯(lián)試劑、清洗試劑、脫保護(hù)試劑、清洗試劑，以及樹脂的溶脹溶劑都可以參考現(xiàn)有技術(shù)。例如，本技術(shù)優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方案中，樹脂溶脹溶劑為dcm、dmf、dmso和nmp中的至少一種；偶聯(lián)試劑含有氨基酸、縮合試劑、堿和溶劑，其中，縮合試劑為dcc、dic、hatu、hbtu、hctu、tatu、tbtu、comu、pyaop、pybop、bop、hoat、hobt等中的至少一種，氨基酸是20種天然氨基酸或非天然氨基酸中的一種。

35、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，固相載體為固相樹脂。

36、需要說明的是，固相樹脂只是本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中采用的固定多肽的載體；可以理解，在相同的發(fā)明構(gòu)思下，不排除還可以采用其他的固相載體，不僅限于固相樹脂。

37、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，在向填充床反應(yīng)器內(nèi)依序注入用于多肽合成的試劑之前，還包括，在控溫和超聲波場條件下，采用連續(xù)注液的方式，向填充床反應(yīng)器內(nèi)依次注入溶脹和脫保護(hù)試劑，對樹脂進(jìn)行溶脹和脫保護(hù)。

38、本技術(shù)的另一面還公開了一種固相多肽合成的裝置，包括填充床反應(yīng)器和超聲波槽；填充床反應(yīng)器包括中空的反應(yīng)腔體，反應(yīng)腔體內(nèi)放置有多肽合成的固相載體，反應(yīng)腔體的上端設(shè)置有頂部篩板，反應(yīng)腔體的下端設(shè)置有底部篩板，頂部篩板和底部篩板將固相載體封裝在反應(yīng)腔體內(nèi)；并且，頂部篩板和底部篩板僅允許溶液通過，而不允許固相載體通過；填充床反應(yīng)器的頂部開設(shè)有溶液入口，用于溶液注入反應(yīng)腔體內(nèi)；填充床反應(yīng)器的底部開設(shè)有溶液出口，用于溶液從反應(yīng)腔體內(nèi)流出；超聲波槽的側(cè)壁上安裝有超聲發(fā)生器，超聲波槽用于容納液體介質(zhì)和填充床反應(yīng)器。

39、使用時，填充床反應(yīng)器放置于超聲波槽內(nèi)，超聲波槽內(nèi)裝有液體介質(zhì)，通過超聲發(fā)生器產(chǎn)生均勻的超聲波場，并通過液體介質(zhì)將超聲波場傳導(dǎo)給填充床反應(yīng)器，使整個固相多肽合成過程都在超聲波條件下進(jìn)行。

40、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，超聲波槽內(nèi)還安裝有溫控裝置，溫控裝置包括加熱器、溫度傳感器和控制器；加熱器用于提供恒溫加熱；溫度傳感器用于實(shí)時監(jiān)控超聲波槽內(nèi)的溫度；控制器用于根據(jù)溫度傳感器監(jiān)控的溫度實(shí)時開啟或關(guān)閉加熱器，從而控制超聲波槽內(nèi)的溫度。

41、使用時，填充床反應(yīng)器放置于超聲波槽內(nèi)，超聲波槽內(nèi)裝有液體介質(zhì)，通過加熱裝置和超聲發(fā)生器形成恒溫?zé)嵩『统暡▓龅膹?fù)合反應(yīng)條件，并通過液體介質(zhì)傳導(dǎo)給填充床反應(yīng)器，使整個固相多肽合成過程都在恒溫和超聲波場條件下進(jìn)行。

42、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，固相載體為固相樹脂。

43、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，超聲波槽內(nèi)的液體介質(zhì)為水。

44、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，填充床反應(yīng)器的頂部具有反應(yīng)器頂蓋，用于將頂部篩板、固相載體和底部篩板固定在反應(yīng)腔體內(nèi)。

45、本技術(shù)的一種實(shí)現(xiàn)方式中，頂部篩板和底部篩板的孔徑為5-50μm。

46、由于采用以上技術(shù)方案，本技術(shù)的有益效果在于：

47、本技術(shù)的固相多肽合成方法，采用流動化學(xué)技術(shù)路線和填充床反應(yīng)器，通過超聲波輔助和控溫，可以實(shí)現(xiàn)快速合成多肽，不僅提高多肽合成的速度，縮短了多肽縮合反應(yīng)的時間和氨基酸脫保護(hù)的時間，從而提高多肽固相合成的生產(chǎn)效率；而且，通過超聲波輔助，提高了多肽合成過程中的傳質(zhì)傳熱效率，提高了每個氨基酸的平均偶聯(lián)產(chǎn)率，提高了目標(biāo)多肽的純度。