本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)合成，具體涉及一種膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的無(wú)細(xì)胞表達(dá)方法。

背景技術(shù)：

1、微生物胞外多糖不僅有助于細(xì)胞間的相互吸附和識(shí)別作用、對(duì)外界極端環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)、吸附外源有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物；更重要的是，胞外多糖的優(yōu)良流變性、乳化性和絮凝活性，賦予了其免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等特殊的生物活性。因此，微生物胞外多糖重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和工業(yè)用途引起了人們的廣泛關(guān)注。

2、微生物胞外多糖及糖綴合物(糖脂、糖蛋白)的生物合成依賴于磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)啟動(dòng)糖重復(fù)單元或糖綴合物前體的組裝。在磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，糖核苷酸和脂載體(und-p)形成und-pp-糖。磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶分為兩個(gè)家族：聚異戊二烯基磷酸n-乙酰氨基糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(pnpt)和聚異戊二烯基磷酸己糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(phpt)。然而，由于磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶是一種整合膜蛋白，其疏水結(jié)構(gòu)域使其難以在大腸桿菌等生物體內(nèi)過(guò)表達(dá)，如何獲得純度高、穩(wěn)定性好的膜蛋白仍然是表征磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的重大挑戰(zhàn)，一定程度上限制了研究人員對(duì)微生物胞外多糖生物合成機(jī)制的解析和對(duì)糖分子組成的調(diào)控。

3、傳統(tǒng)膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)方法是通過(guò)融合分子伴侶或sumo、trxa等促溶標(biāo)簽于大腸桿菌等胞內(nèi)表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)(protein?expression?and?purification?207(2023)106273、glycobiology,2012,22(1):116–122)，而后使用ddm、triton?x-100、chaps等系列表面活性劑從膜中提取或重構(gòu)胞內(nèi)表達(dá)的不溶性蛋白沉淀(journal?ofbiological?chemis?try,2023,299(10):105194、antimicrobial?agents?andchemotherapy,2017,61(11):e01310-17、mbio,2023,14(5):e00948-23.)，從而將其溶解至洗滌劑膠束中，獲得可溶性蛋白樣品。盡管如此，目前對(duì)膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的功能研究與晶體結(jié)構(gòu)解析仍然非常困難。這主要是由于膜蛋白過(guò)表達(dá)易引起細(xì)胞毒性，其表達(dá)量及純度尚未達(dá)到結(jié)構(gòu)分析的要求；而且并非所有的表面活性劑所形成的膠束均能在體外重構(gòu)或在體內(nèi)提取磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶，并使其具備相應(yīng)功能活性，這一過(guò)程仍需對(duì)促溶標(biāo)簽或表面活性劑進(jìn)行冗雜的篩選與優(yōu)化過(guò)程。因此，傳統(tǒng)研究手段對(duì)實(shí)現(xiàn)膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的功能性表達(dá)尚存在明顯的局限性，亟需尋找一種實(shí)現(xiàn)膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶可溶性表達(dá)的高效方法。

4、近年來(lái)，隨著合成生物技術(shù)的進(jìn)步，基于細(xì)胞提取物的無(wú)細(xì)胞蛋白合成(cell-free?protein?synthesis，cfps)系統(tǒng)成為有望替代胞內(nèi)系統(tǒng)的開放式蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，在外源補(bǔ)充能量體系、氨基酸、輔因子、基因模板等必須物質(zhì)的情況下可于體外實(shí)現(xiàn)中心法則，控制基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯，數(shù)小時(shí)內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的高效合成。與傳統(tǒng)的基于胞內(nèi)的表達(dá)體系相比，cfps不僅操作簡(jiǎn)便、效率高，還突破了蛋白合成與細(xì)胞活性之間關(guān)系的瓶頸，為膜蛋白的功能性表達(dá)提供了一種新的途徑。

5、目前，基于表面活性劑的模式(detergent?based?cell-free，dcf)和基于脂質(zhì)的模式(lipid?based?cell-free，lcf)以被應(yīng)用于cfps系統(tǒng)中表達(dá)膜蛋白，使目的膜蛋白以可溶形式與膠束或脂質(zhì)體共翻譯。dcf模式在組裝cfps反應(yīng)體系時(shí)直接補(bǔ)充表面活性劑，膜蛋白可利用其形成的膠束穩(wěn)定其疏水結(jié)構(gòu)域；而lcf模式則補(bǔ)充納米脂質(zhì)體、納米磷脂盤等脂質(zhì)膜組件，使膜蛋白疏水結(jié)構(gòu)域整合于磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)中。friederike?junge于無(wú)細(xì)胞體系中補(bǔ)充0.5％brij35，以dcf模式成功獲得內(nèi)皮素受體a的可溶性蛋白樣品(journalof?structural?biology,2010,172(1):94–106)；ke?yue則制備了一種脂質(zhì)體，以lcf模式實(shí)現(xiàn)水通道蛋白aqpz的可溶性表達(dá)(cells,2019,8(11):1325.)；michael?c.jewett團(tuán)隊(duì)以ddm、triton?x-100以及popc納米磷脂盤作為人工疏水材料，以dcf或lcf模式于cfps系統(tǒng)中獲得可溶性寡糖基轉(zhuǎn)移酶cjpglb(biotechnology?and?bioengineering,2018,115(3):739–750.)。

6、然而，目前使用cfps系統(tǒng)制備磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的研究鮮有報(bào)道。這主要是由于cfps系統(tǒng)中缺乏生物膜環(huán)境，還需針對(duì)磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶這一特定蛋白進(jìn)行膜增強(qiáng)型系統(tǒng)改造。此外，不同膜蛋白的理化性質(zhì)差異導(dǎo)致其最適疏水材料的不同，加之商業(yè)化納米磷脂盤的成本較高，限制了該技術(shù)在磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶體外制備的進(jìn)一步應(yīng)用。

7、因此，篩選合適的疏水材料，并建立適用于膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶可溶性表達(dá)的無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的目的在于提供一種膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的無(wú)細(xì)胞表達(dá)方法，解決目前膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶合成過(guò)程中表達(dá)效率較低、溶解性能不佳、難以折疊成活性口袋系列難題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的實(shí)施例在提出了一種膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的無(wú)細(xì)胞表達(dá)方法，其包括以下步驟：

3、構(gòu)建含編碼膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtp或epsl的重組質(zhì)粒；

4、制備納米脂質(zhì)體；

5、制備大腸桿菌rosetta(de3)細(xì)胞提取物；

6、將所述重組質(zhì)粒加入到包含所述大腸桿菌rosetta(de3)細(xì)胞提取物、反應(yīng)緩沖液的無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系中，同時(shí)將表面活性劑或納米脂質(zhì)體作為人工疏水材料補(bǔ)充至所述無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系，混勻后至于20～30℃恒溫?fù)u床中孵育8～12h，以實(shí)現(xiàn)gtp或epsl膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的高效可溶性表達(dá)。

7、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的一種膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的無(wú)細(xì)胞表達(dá)方法，以基于大腸桿菌rosetta(de3)細(xì)胞提取物的膜增強(qiáng)型無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)作為重要蛋白合成平臺(tái)，數(shù)小時(shí)內(nèi)即可于1.5ml?ep管中實(shí)現(xiàn)膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶gtp、epsl的可溶性表達(dá)，大大減少了獲得膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的時(shí)間成本、簡(jiǎn)化了其生產(chǎn)工藝，有效避免傳統(tǒng)方法表達(dá)過(guò)程繁瑣、表達(dá)量低等問(wèn)題，不僅為膜蛋白的高效可溶性表達(dá)提供了新方法，也為膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)解析與功能研究奠定了基礎(chǔ)。

8、另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例提出的一種膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的無(wú)細(xì)胞表達(dá)方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

9、可選地，膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶gtp的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶epsl的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

10、可選地，構(gòu)建含編碼膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtp或epsl的重組質(zhì)粒的步驟為：

11、以地衣芽孢桿菌cgmcc?2876基因組為模板，pcr擴(kuò)增膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtp、膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsl，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化pivex?2.4c載體通過(guò)gibson組裝進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組子進(jìn)行測(cè)序，獲得pivex2.4c-gtp重組質(zhì)粒、pivex2.4c-epsl重組質(zhì)粒。

12、進(jìn)一步，pcr擴(kuò)增膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtp使用的引物如seq?id?no.3、seqidno.4所示；pcr擴(kuò)增膜結(jié)合磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsl使用的引物如seq?id?no.5、seqidno.6所示。

13、可選地，所述納米脂質(zhì)體的制備包括：

14、將磷脂和膽固醇溶解于有機(jī)溶劑中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成脂質(zhì)薄膜，去除有機(jī)溶劑后加入磷酸鹽緩沖液，于45℃下攪拌水合1h，收集脂質(zhì)懸液后，立即通過(guò)超聲能量和機(jī)械能的聯(lián)合作用減小脂質(zhì)體粒徑，獲得納米脂質(zhì)體。

15、進(jìn)一步，所述有機(jī)溶劑為氯仿和甲醇，比例為3:1；所述磷脂和所述膽固醇的比例為4:1；所述磷酸鹽緩沖液加入量為：每20mg磷脂加入1ml磷酸鹽緩沖液。

16、進(jìn)一步，通過(guò)超聲能量和機(jī)械能的聯(lián)合作用為：使用20％的功率，超聲10min后立即通過(guò)含100～200nm聚碳酸酯膜的脂質(zhì)體擠出機(jī)21～31次。

17、可選地，所述反應(yīng)緩沖液的組分為hepes、atp、ctp、gmp、ump、輔酶a、trna、亞葉酸、亞精胺、谷氨酸鉀、谷氨酸鎂、二硫蘇糖醇、三磷酸甘油酸、多種氨基酸、煙酰胺二核苷酸、peg6000。

18、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。