本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種人多能干細(xì)胞3d分化來源的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc及其培養(yǎng)基和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、毛囊的形態(tài)發(fā)生和再生依賴于上皮(上皮干細(xì)胞[epsc])和毛發(fā)誘導(dǎo)間充質(zhì)(真皮毛乳頭細(xì)胞[dpc])成分的密切合作，也稱為上皮-間充質(zhì)相互作用(emi)。emi是功能性毛囊形成、再生和循環(huán)的先決條件，并作為組織工程用于毛囊再生的理論基礎(chǔ)。

2、目前體內(nèi)再生毛囊的策略旨在模擬emi，主要采用結(jié)合上皮(上皮干細(xì)胞[epsc]或人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(human?epidermal?keratinocytes，簡(jiǎn)稱hek)和間充質(zhì)(真皮毛乳頭細(xì)胞[dpc]或皮膚來源的前體細(xì)胞(skin-derived?precursors，簡(jiǎn)稱skp))配合誘導(dǎo)毛囊再生。

3、目前，人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞hek、真皮毛乳頭細(xì)胞dpc、皮膚來源的前體細(xì)胞skp等細(xì)胞均可以在體外獲得。有研究報(bào)道，移植真皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞混合物可使功能性毛囊再生，但僅接受真皮細(xì)胞(例如dpc)的小鼠都沒有可見的毛發(fā)生長(zhǎng)(dpc可能能誘導(dǎo)毛囊結(jié)構(gòu)，但沒有可見的毛發(fā)穿出生長(zhǎng)，見圖8)，說明雖然真皮細(xì)胞(例如dpc)在單獨(dú)注射時(shí)不能誘導(dǎo)獲得可檢測(cè)到的毛發(fā)生長(zhǎng)，但當(dāng)真皮細(xì)胞(例如dpc)與上皮細(xì)胞(例如hek)混合時(shí)，有助于頭發(fā)穿出并生長(zhǎng)，對(duì)于研究毛發(fā)再生具有重要意義。

4、但是，毛發(fā)再生的研究仍然面臨很多挑戰(zhàn)，例如，人類上皮細(xì)胞主要來源有兩種，一種是用人類皮膚或毛囊組織進(jìn)行原代分離(例如原代分離的hek細(xì)胞)，但來源有限且較難增殖；另一種是使用多能干細(xì)胞進(jìn)行分化獲得，可以解決細(xì)胞來源問題，而多能干細(xì)胞分化有兩種路徑，一種是單層細(xì)胞貼附培養(yǎng)的2d分化路徑，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單成本低，易于觀察和大規(guī)模生產(chǎn)；另一種是先形成細(xì)胞團(tuán)(擬胚體或稱eb球)再進(jìn)行貼壁分化的3d分化路徑，盡管3d分化技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，成交較高，觀察和操作難度大，但由于可以更好地模擬體內(nèi)三維環(huán)境，功能更接近體內(nèi)細(xì)胞，具有更大的研究?jī)r(jià)值。

5、但目前的3d分化仍然存在很大的挑戰(zhàn)，包括：

6、(a)目前有較多的方法和培養(yǎng)基可以使多能干細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)(擬胚體或稱eb球)，例如，自聚集、懸滴法和aggrewell等方法均可形成eb球，但并不是所有方法都有利于hpsc向hepsc的分化，例如，形成eb球后分化時(shí)出現(xiàn)容易破裂和不貼壁的問題，或者形成eb球后前期貼壁分化正常，但分化到后期還會(huì)出現(xiàn)容易出現(xiàn)開裂和貼壁差的問題。

7、(b)已有的3d分化培養(yǎng)體系時(shí)程過長(zhǎng)(普遍在30-50天)、分化效率不穩(wěn)定(需要連續(xù)傳代純化才能獲得人上皮細(xì)胞)，限制了它們的臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的

2、為克服上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種人多能干細(xì)胞3d分化來源的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc及其培養(yǎng)基和應(yīng)用。本發(fā)明在研究人多能干細(xì)胞(hpsc)3d分化擬獲得hek細(xì)胞的過程中，意外獲得了一種不同于hek、傳統(tǒng)毛囊來源的hepsc的新的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc，分化獲得的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上高表達(dá)上皮干細(xì)胞標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白5(krt15)、角蛋白18(k18)、p63和itga6(整合素亞基α6)，而不表達(dá)或低表達(dá)與hek特異性相關(guān)的標(biāo)志物角蛋白14(k14)(區(qū)別于hek)和與hpsc相關(guān)的標(biāo)志物oct4和nanog(安全性高，不具有潛在成瘤性)，也極低表達(dá)cd200(不同于傳統(tǒng)的毛囊來源的hepsc)，itga6的相對(duì)表達(dá)量也遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的毛囊來源的hepsc。本發(fā)明通過人多能干細(xì)胞(hpsc)可快速、穩(wěn)定且高效地分化為人上皮干細(xì)胞3d-hepsc，分化時(shí)間大大縮短(分化時(shí)間僅需14～20天)，本發(fā)明獲得的細(xì)胞團(tuán)(eb球)能高效分化，不容易破裂或貼壁變差，分化穩(wěn)定性大大提高。且本發(fā)明的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc的以人多能干細(xì)胞(hpsc)為獲取來源，獲取簡(jiǎn)便，本發(fā)明獲得的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在與dpc細(xì)胞混合移植時(shí)，能成功讓裸鼠長(zhǎng)出大量毛發(fā)，具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3、解決方案

4、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

5、第一方面，本發(fā)明提供了一種人多能干細(xì)胞3d分化來源的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc，于2024年6月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.46003。

6、進(jìn)一步地，相對(duì)hpsc細(xì)胞(human?pluripotent?stem?cell，縮寫hpsc)中的h9細(xì)胞系，人上皮干細(xì)胞3d-hepsc高表達(dá)標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白15、角蛋白18、轉(zhuǎn)錄因子p63和itga6，不表達(dá)或極低表達(dá)nanog、oct4，且極低表達(dá)cd200；

7、人上皮干細(xì)胞3d-hepsc相對(duì)原代hek細(xì)胞不表達(dá)或極低表達(dá)角蛋白14。

8、進(jìn)一步地，人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上的角蛋白18表達(dá)量是h9細(xì)胞系的8倍以上。

9、進(jìn)一步地，人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上的itga6表達(dá)量是h9細(xì)胞系的5～8倍，可選地為5～6倍。

10、進(jìn)一步地，人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上的角蛋白15表達(dá)量是h9細(xì)胞系的40倍以上。

11、進(jìn)一步地，人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上的轉(zhuǎn)錄因子p63表達(dá)量是h9細(xì)胞系的1000或1200倍以上。

12、進(jìn)一步地，人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上相對(duì)h9細(xì)胞系的nanog、oct4表達(dá)量趨近于0。

13、進(jìn)一步地，人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上的cd200表達(dá)量是h9細(xì)胞系的1/5或更低。

14、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于分化獲得第一方面所述的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc的分化培養(yǎng)基，其包括分化培養(yǎng)基1或分化培養(yǎng)基2、或分化培養(yǎng)基1與分化培養(yǎng)基2的組合；

15、其中，分化培養(yǎng)基1包括：dmem培養(yǎng)基，并含有：20％血清替代物，1×neaa，1×glutamax，0.055mmβ-巰基乙醇，1×青霉素-鏈霉素雙抗溶液，1～10μm視黃酸，10～50μm骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和10μm?rock抑制劑；

16、分化培養(yǎng)基2包括：dksfm培養(yǎng)基，并包含1～10μm視黃酸，10～50μm骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)和10μm?rock抑制劑，可選地rock抑制劑為y27632。

17、進(jìn)一步地，分化培養(yǎng)基1包括dmem培養(yǎng)基，并含有：20％血清替代物，1×neaa，1×glutamax，0.055mmβ-巰基乙醇，1×青霉素-鏈霉素雙抗溶液，1μm視黃酸(ra)，25μm骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)和10μm?rock抑制劑，可選地rock抑制劑為y27632。

18、進(jìn)一步可選地，分化培養(yǎng)基2包括：dksfm培養(yǎng)基，并包含1μm視黃酸(ra)，25μm骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)，10μm?y27632。

19、進(jìn)一步可選地，分化培養(yǎng)基1中，血清替代物為knockout-serum?replacement。

20、進(jìn)一步可選地，分化培養(yǎng)基1中，dmem培養(yǎng)基為knockout?dmem。

21、進(jìn)一步可選地，分化培養(yǎng)基1中，1×neaa采用100×mem非必需氨基酸溶液稀釋到dmem培養(yǎng)基中獲得。

22、第三方面，提供一種用于分化獲得第一方面所述的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc的分化方法，包括如下步驟：

23、1)擴(kuò)增培養(yǎng)hpsc細(xì)胞成克隆塊，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞；

24、2)將步驟1)的單細(xì)胞進(jìn)行3d培養(yǎng)，采用eb形成培養(yǎng)基形成細(xì)胞團(tuán)；可選地，eb形成培養(yǎng)基包括：dmem培養(yǎng)基，并含有：20％血清替代物，1xneaa，1×glutamax，0.055mmβ-巰基乙醇，1×青霉素-鏈霉素雙抗溶液，1～10μm視黃酸和10～50μm骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和100μm的rock抑制劑；可選地，rock抑制劑為y27632；

25、3)將步驟2)獲得的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行分化；采用第二方面所述的分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，其中，先用分化培養(yǎng)基1適應(yīng)性分化1～2天，再用分化培養(yǎng)基2分化培養(yǎng)3～5天，轉(zhuǎn)入d-ksfm培養(yǎng)4～6天，獲得分化的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc。

26、進(jìn)一步地，步驟3)中，采用分化培養(yǎng)基2分化培養(yǎng)過程中1～2天更換一次培養(yǎng)基；

27、和/或，采用d-ksfm培養(yǎng)過程中，每20～28h更換一次培養(yǎng)基，可選地更換時(shí)間為24h。

28、進(jìn)一步地，步驟1)中，培養(yǎng)板采用vitronectin包被。

29、進(jìn)一步地，步驟1)中，采用hpsc培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。

30、進(jìn)一步地，步驟1)中，當(dāng)細(xì)胞傳代至克隆邊緣清晰、核質(zhì)比高、形態(tài)均一，克隆內(nèi)細(xì)胞間接觸緊密狀態(tài)，匯合度在60％左右，將克隆塊分散重懸為細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)。

31、進(jìn)一步地，步驟2)中，細(xì)胞團(tuán)形成方法包括自聚集法、懸滴法、aggrewell法中的至少一種。

32、進(jìn)一步地，步驟2)中，細(xì)胞成團(tuán)過程中不移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿。

33、進(jìn)一步地，步驟2)中，細(xì)胞團(tuán)形成后，轉(zhuǎn)入低吸附培養(yǎng)皿中；可選地，細(xì)胞團(tuán)形成后，采用eb形成培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1～2天；可選地，繼續(xù)培養(yǎng)后將細(xì)胞團(tuán)接種到膠原蛋白iv包被的孔板中，加步驟2)所述的eb形成培養(yǎng)基和2％?fbs培養(yǎng)過夜，用于分化。

34、第四方面，本發(fā)明提供了一種用于毛發(fā)再生的細(xì)胞組合物，包括人真皮毛乳頭細(xì)胞(dpc)和第一方面所述的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc或第二方面所述的分化方法獲得的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc；

35、可選地，dpc細(xì)胞和人上皮干細(xì)胞數(shù)量比為1：(1～3)，可選地為1：(2～3)。

36、第五方面，本發(fā)明提供了一種第一方面所述的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc或第四方面所述的分化方法獲得的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc或第五方面所述的細(xì)胞組合物在制備毛發(fā)再生產(chǎn)品中的應(yīng)用。

37、另一方面，本發(fā)明提供了一種第一方面所述的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc或第三方面所述的分化方法獲得的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc或第四方面所述的細(xì)胞組合物在進(jìn)行毛發(fā)再生的方法，向有需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的上述含有人上皮干細(xì)胞3d-hepsc與dpc細(xì)胞的細(xì)胞組合物。

38、有益效果

39、本發(fā)明在研究人多能干細(xì)胞(hpsc)3d分化擬獲得hek細(xì)胞的過程中，意外獲得了一種不同于hek、傳統(tǒng)毛囊來源的hepsc的新的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc，分化獲得的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在mrna水平上高表達(dá)上皮干細(xì)胞標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白5(krt15)、角蛋白18(k18)、p63和itga6，而不表達(dá)或低表達(dá)與hek特異性相關(guān)的標(biāo)志物角蛋白14(k14)(區(qū)別于hek)和與hpsc相關(guān)的標(biāo)志物oct4和nanog(安全性高，不具有潛在成瘤性)，也極低表達(dá)cd200(不同于傳統(tǒng)的毛囊來源的hepsc)，itga6的相對(duì)表達(dá)量也遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的毛囊來源的hepsc。本發(fā)明通過人多能干細(xì)胞(hpsc)可快速、穩(wěn)定且高效地分化為人上皮干細(xì)胞3d-hepsc，分化時(shí)間大大縮短(分化時(shí)間僅需14～20天)，本發(fā)明獲得的細(xì)胞團(tuán)(eb球)能高效分化，不容易破裂或貼壁變差，分化穩(wěn)定性大大提高。且本發(fā)明的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc的以人多能干細(xì)胞(hpsc)為獲取來源，獲取簡(jiǎn)便，本發(fā)明獲得的人上皮干細(xì)胞3d-hepsc在與dpc細(xì)胞混合移植時(shí)，能成功讓裸鼠長(zhǎng)出大量毛發(fā)，具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。