本發(fā)明屬于水環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種基于rpa-crispr/cas12a-lfd技術(shù)的小普林藻檢測方法。

背景技術(shù)：

1、小普林藻(prymnesium?parvum)屬于定鞭金藻門(haptophyta)，顆石藻綱(coccolithophyceae)，定鞭金藻目(prymnesiales)，定鞭藻科(prymnesiaceae)，普林藻屬(prymnesium)，于1930年在丹麥水域首次發(fā)現(xiàn)并被記錄，為全球廣布種。小普林藻是美國非藍(lán)藻內(nèi)陸有害藻華物種中，影響最大的藻種，影響至少23個(gè)洲，造成了數(shù)千萬美元的經(jīng)濟(jì)損失。在中國，近年來雖然沒有沿海小普林藻藻華暴發(fā)的報(bào)道，但在養(yǎng)殖池塘中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)高密度的小普林藻，細(xì)胞密度達(dá)到102-107cells/ml。值得注意的是，即使在看不到大量繁殖的情況下，低密度的小普林藻也會影響生態(tài)系統(tǒng)。因此，監(jiān)測水環(huán)境中小普林藻的蹤跡對生態(tài)保護(hù)和水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展具有重要意義。

2、目前，用于小普林藻檢測的方法主要分為傳統(tǒng)的鏡檢法以及分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的鏡檢法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專家才能進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定，在各類檢測方法中并無優(yōu)勢。采用pcr和分子探針等分子檢測技術(shù)雖具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但其對實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求過高，且需要專業(yè)人員進(jìn)行檢測，無法實(shí)現(xiàn)有害藻類的野外快速檢測這一目標(biāo)。

3、本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase?polymeraseamplification，rpa)實(shí)現(xiàn)了野外快速檢測，但是，我們?nèi)匀幌ＭM(jìn)一步提高其檢測靈敏度和特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種檢測水樣中小普林藻的方法，包括以下步驟：

2、s1：提取所述水樣中的dna；

3、s2：通過重組酶聚合酶擴(kuò)增法擴(kuò)增特征位點(diǎn)，得到rpa擴(kuò)增產(chǎn)物，所述特征位點(diǎn)的序列如seq?id?no:2所示；

4、s3：用所述rpa擴(kuò)增產(chǎn)物配制crispr-12a反應(yīng)體系，進(jìn)行crispr反應(yīng)，得到crispr反應(yīng)產(chǎn)物；

5、s4：檢測所述crispr反應(yīng)產(chǎn)物中的標(biāo)記分子。

6、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，s2中，擴(kuò)增所述特征位點(diǎn)所用的引物序列如seq?id?no:8和9所示。

7、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，s3中，所述crispr-12a反應(yīng)體系還包括以下成分：cas12a蛋白、帶有標(biāo)記分子的ssdna、crrna。

8、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述帶有標(biāo)記分子的ssdna的濃度為500nmol/l。

9、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，crispr的反應(yīng)時(shí)間為40min。

10、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，s4中使用固定了能夠捕獲所述標(biāo)記分子的物質(zhì)的橫向流動(dòng)試紙條檢測所述標(biāo)記分子。

11、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，s4中，所述反應(yīng)產(chǎn)物中加入peg后再進(jìn)行橫向流動(dòng)試紙條檢測，peg的工作濃度為4.6％。

12、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述橫向流動(dòng)試紙條采用金標(biāo)納米粒作為顯色劑，并且，金標(biāo)納米粒含量為1.5×102pg/μl。

13、本發(fā)明所提供的小普林藻的rpa-crispr/cas12a-lfd檢測方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：

14、1.靈敏度高，基因組最低檢測限可達(dá)到1.5×10-2pg/μl，模擬樣本最低檢測限可達(dá)到1.12×10-2cells/ml。

15、2.特異性好，crrna及rpa引物均根據(jù)小普林藻的its靶標(biāo)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。

16、3.檢測速度快，僅需兩步反應(yīng)即可完成檢測。

17、4.對儀器設(shè)備的要求低，無需pcr儀、電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)，只需一個(gè)恒溫加熱器即可完成擴(kuò)增和檢測。

18、5.對操作人員的專業(yè)素養(yǎng)要求較低，無需專業(yè)的藻類學(xué)專家，只需要稍微有一點(diǎn)分子生物學(xué)基礎(chǔ)即可完成小普林藻的全部檢測流程。

技術(shù)特征：

1.一種檢測水樣中小普林藻的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，s2中，擴(kuò)增所述特征位點(diǎn)所用的引物序列如seq?id?no:8和9所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，s3中，所述crispr-12a反應(yīng)體系還包括以下成分：cas12a蛋白、帶有標(biāo)記分子的ssdna、crrna。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述帶有標(biāo)記分子的ssdna的濃度為500nmol/l。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，crispr的反應(yīng)時(shí)間為40min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，s4中使用固定了能夠捕獲所述標(biāo)記分子的物質(zhì)的橫向流動(dòng)試紙條檢測所述標(biāo)記分子。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，s4中，所述反應(yīng)產(chǎn)物中加入peg后再進(jìn)行橫向流動(dòng)試紙條檢測，peg的工作濃度為4.6％。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述橫向流動(dòng)試紙條采用金標(biāo)納米粒作為顯色劑，并且，金標(biāo)納米粒含量為1.5×10-2pg/μl。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于RPA?CRISPR/Cas12a?LFD技術(shù)的小普林藻檢測方法。該方法：靈敏度高，基因組最低檢測限可達(dá)到1.5×10<supgt;?2</supgt;pg/μL，模擬樣本最低檢測限可達(dá)到1.12×10<supgt;?2</supgt;cells/mL；特異性好，crRNA及RPA引物均根據(jù)小普林藻的ITS靶標(biāo)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)；檢測速度快，僅需兩步反應(yīng)即可完成檢測；對儀器設(shè)備的要求低，無需PCR儀、電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)，只需一個(gè)恒溫加熱器即可完成擴(kuò)增和檢測；對操作人員的專業(yè)素養(yǎng)要求較低，無需專業(yè)的藻類學(xué)專家，只需要稍微有一點(diǎn)分子生物學(xué)基礎(chǔ)即可完成小普林藻的全部檢測流程。

技術(shù)研發(fā)人員：黃海龍,姜海波,羅寧建,王鑫威,陳未中
受保護(hù)的技術(shù)使用者：寧波大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9