本發(fā)明主要涉及一種抑制豬輪狀病毒的納豆芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥、畜牧。

背景技術(shù)：

1、豬輪狀病毒病是由豬輪狀病毒(porcine?rotavirus，porv)引起的一種以腹瀉、嘔吐、厭食、脫水為臨床癥狀的急性胃腸炎傳染病。porv屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是無囊膜的雙鏈核糖核酸(dsrna)病毒，包含11段dsrna基因組，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白vp1～vp4、vp6、vp7和6種非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1～nsp6。其中，nsp5和vp6是病毒入侵和復(fù)制的重要組成部分。豬輪狀病毒是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)仔豬劇烈腹瀉的主要病原之一，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬輪狀病毒感染具有潛伏期短、傳染性強、流行范圍廣、發(fā)病率高等特征，常與其他細(xì)菌、病毒混合感染而使病情加重，導(dǎo)致患病豬群死亡率升高。

2、預(yù)防豬輪狀病毒的疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗，滅活疫苗安全性良好、易運輸和保存，但免疫效果得不到保證，且注射劑量大、成本高；弱毒疫苗免疫時效快，但存在毒力返強的風(fēng)險。然而，目前針對porv還沒有特異性治療藥物。為此，本發(fā)明了一種可以有效治療porv感染的方法。所用益生菌繁殖快速、生命力強、安全無毒。本發(fā)明為研究豬輪狀病毒提供了新的研究方向，同時為生產(chǎn)抗病毒藥物或飼料添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種抑制豬輪狀病毒的納豆芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏能夠有效作用于輪狀病毒感染豬腸上皮細(xì)胞的納豆芽孢桿菌的技術(shù)問題。

2、本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案為一種重組納豆芽孢桿菌，所述重組納豆芽孢桿菌是以保藏編號為cctcc?cb?20081702的納豆芽孢桿菌為底盤菌株，并在所述底盤菌株上過表達(dá)有degu調(diào)控蛋白(degu)的突變體，所述突變體是對degu調(diào)控蛋白親本的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變。

3、在某些實施方式中，所述親本的編碼基因(degu基因)的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，degu基因的genebank?id為cp101933.1。

4、在某些實施方式中，所述突變體是將degu調(diào)控蛋白親本的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

5、進(jìn)一步，所述突變體的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

6、本發(fā)明提供的第二個技術(shù)方案為一種重組納豆芽孢桿菌的構(gòu)建方法，所述方法為在底盤菌株上過表達(dá)有degu調(diào)控蛋白(degu)的突變體，所述底盤菌株為保藏編號為cctcccb?20081702的納豆芽孢桿菌，所述突變體是對degu調(diào)控蛋白親本的的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

7、在某些實施方式中，所述親本的編碼基因(degu基因)的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，degu基因的genebank?id為cp101933.1。

8、在某些實施方式中，所述突變體的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

9、在某些實施方式中，包括如下步驟：(1)以納豆芽孢桿菌的總dna為模板，用pcr擴(kuò)增出degu基因，與載體phy-p43連接，獲得重組質(zhì)粒phy-p43-degu；

10、(2)采用dpn?i法以步驟(1)的重組質(zhì)粒phy-p43-degu為模板點突變degu基因，獲得degu’基因；

11、(3)以p7c6質(zhì)粒、bs00基因組、步驟(2)的degu’基因為模板，通過三段融合pcr方法將含有氯霉素抗性基因的lox71-cmr-lox66盒及degu’基因片段連接到一起，獲得融合片段cmr-degu’；

12、(4)將步驟(3)中的融合片段cmr-degu’轉(zhuǎn)化至納豆芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后通過cre/lox重組系統(tǒng)，敲除菌株中氯霉素抗性基因，得到重組納豆芽孢桿菌。

13、本發(fā)明提供的第三個技術(shù)方案為一種產(chǎn)品，含有第一個技術(shù)方案所述的重組拿到芽孢桿菌。

14、在某些實施方式中，所述產(chǎn)品包括微生物制劑、組合物和飼料添加劑。

15、在某些實施方式中，所述重組納豆芽孢桿菌在所述產(chǎn)品中的添加量為不低于1×106cfu/ml或1×106cfu/g。

16、本發(fā)明提供的第四個技術(shù)方案為第一個技術(shù)方案所述的納豆芽孢桿菌，或者第三個技術(shù)方案所述的產(chǎn)品在制備用于治療和/或緩解豬輪狀病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明提供的第五個技術(shù)方案為一種體外抑制輪狀病毒感染豬腸上皮細(xì)胞的方法，所述方法為利用第一個技術(shù)方案所述的納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，獲得的發(fā)酵產(chǎn)物與輪狀病毒感染的豬腸上皮細(xì)胞接觸。

18、本發(fā)明提供的第六個技術(shù)方案為第一個技術(shù)方案所述的納豆芽孢桿菌在制備抑制輪狀病毒感染豬腸上皮細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

19、在某些實施方式中，所述抑制至少包括如下一種作用：

20、(1)降低輪狀病毒感染豬腸上皮細(xì)胞的nsp5基因表達(dá)；

21、(2)降低輪狀病毒滴度；

22、(3)降低輪狀病毒感染豬腸上皮細(xì)胞的vp6蛋白的表達(dá)。

23、本發(fā)明提供的第七個技術(shù)方案為一種degu調(diào)控蛋白的突變體，所述突變體是對degu調(diào)控蛋白親本的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變?yōu)榫彼幔鲇H本的核苷酸序列如如seqid?no:1所示。

24、本發(fā)明的有益效果如下：

25、本發(fā)明通過構(gòu)建一株重組納豆芽孢桿菌，以豬腸上皮細(xì)胞(ipec-j2)為研究對象，根據(jù)是否用porv或原納豆芽孢桿菌發(fā)酵液和構(gòu)建過的納豆芽孢桿菌發(fā)酵液(100μl)處理ipec-j2細(xì)胞，分別設(shè)置陰性對照組、porv感染組和發(fā)酵液+porv感染組。通過檢測porv在ipec-j2細(xì)胞的復(fù)制與增殖情況，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建好的納豆芽孢桿菌能有效抑制了豬輪狀病毒的復(fù)制，本發(fā)明在抗病毒藥物生產(chǎn)和飼料添加劑上具有廣泛的用途。

技術(shù)特征：

1.一種重組納豆芽孢桿菌，其特征在于，所述重組納豆芽孢桿菌是以保藏編號為cctcccb?20081702的納豆芽孢桿菌bs00為底盤菌株，并在所述底盤菌株上過表達(dá)有degu調(diào)控蛋白的突變體，所述突變體是對degu調(diào)控蛋白親本的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組所述納豆芽孢桿菌，其特征在于，所述親本的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組所述納豆芽孢桿菌，其特征在于，所述突變體是將degu調(diào)控蛋白親本的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

4.一種重組納豆芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法為在底盤菌株上過表達(dá)有degu調(diào)控蛋白的突變體，所述底盤菌株為保藏編號為cctcc?cb?20081702的納豆芽孢桿菌bs00，所述突變體是對degu調(diào)控蛋白親本的的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

6.一種產(chǎn)品，其特征在于，含有權(quán)利要求1～3任一項所述的重組納豆芽孢桿菌。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括微生物制劑、組合物和飼料添加劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述重組納豆芽孢桿菌在所述產(chǎn)品中的添加量為不低于1×106cfu/ml或1×106cfu/g。

9.權(quán)利要求1～3任一項所述的納豆芽孢桿菌，或者權(quán)利要求6～8任一項所述的產(chǎn)品在制備用于治療和/或緩解豬輪狀病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。

10.一種體外抑制輪狀病毒感染豬腸上皮細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法為利用權(quán)利要求1～3任一項所述的納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，獲得的發(fā)酵產(chǎn)物與輪狀病毒感染的豬腸上皮細(xì)胞接觸。

11.權(quán)利要求1～3任一項所述的納豆芽孢桿菌在制備抑制輪狀病毒感染豬腸上皮細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制至少包括如下一種作用：

13.一種degu調(diào)控蛋白的突變體，其特征在于，所述突變體是對degu調(diào)控蛋白親本的hth區(qū)域第74位亮氨酸突變?yōu)榫彼幔鲇H本的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種抑制豬輪狀病毒的納豆芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥、畜牧技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過構(gòu)建一株重組納豆芽孢桿菌，以豬腸上皮細(xì)胞(IPEC?J2)為研究對象，根據(jù)是否用PoRV或原納豆芽孢桿菌發(fā)酵液和構(gòu)建過的納豆芽孢桿菌發(fā)酵液(100μL)處理IPEC?J2細(xì)胞，分別設(shè)置陰性對照組、PoRV感染組和發(fā)酵液+PoRV感染組。通過檢測PoRV在IPEC?J2細(xì)胞的復(fù)制與增殖情況，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建好的納豆芽孢桿菌能有效抑制了豬輪狀病毒的復(fù)制，本發(fā)明在抗病毒藥物生產(chǎn)和飼料添加劑上具有廣泛的用途。

技術(shù)研發(fā)人員：吳利,朱文敏,孫毅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：羿旻生物醫(yī)藥科技（東陽）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9