本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體涉及表達(dá)針對her2的p95片段的特異性嵌合抗原受體的免疫細(xì)胞以及針對her2和cd3的雙特異性抗體及其在癌癥治療中的用途。

背景技術(shù)：

1、針對腫瘤相關(guān)或腫瘤特異性抗原的免疫細(xì)胞重定向是針對某些惡性血液病的成功治療策略。相反，迄今為止它針對實(shí)體瘤的治療已失敗。t細(xì)胞可以使用雙特異性抗體進(jìn)行重定向，該雙特異性抗體通常稱為雙特異性t細(xì)胞接合子(bite)或t細(xì)胞雙特異性抗體(tcb)，它們同時結(jié)合腫瘤抗原和t細(xì)胞受體(tcr)的不變亞基，通常是cd3。替代地，可以操縱t細(xì)胞以表達(dá)嵌合抗原受體(car)，其是包含抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及tcr和共激活受體的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的工程化蛋白。

2、與惡性血液病的成功相反，迄今為止，t細(xì)胞重定向針對實(shí)體瘤的治療已失敗。這種失敗的原因包括t細(xì)胞重定向所針對的抗原的下調(diào)、所述抗原表達(dá)的異質(zhì)性以及腫瘤建立的免疫抑制環(huán)境。

3、雖然改進(jìn)雙特異性t細(xì)胞接合子的設(shè)計(jì)以克服此類逃逸機(jī)制具有固有的局限性，但cart細(xì)胞可以用作遞送額外的抗腫瘤因子(諸如細(xì)胞因子或抗體)的平臺。這些所謂的第四代car產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括il-12和il-15。由第四代car-t細(xì)胞遞送的抗體包括靶向免疫檢查點(diǎn)抑制劑的阻斷抗體和靶向腫瘤抗原的雙特異性抗體(choi?et?al.,2019,naturepublishing?group?37,1049–1058)。裝甲car(armored?car)構(gòu)成可擴(kuò)展平臺以抵消上述耐藥機(jī)制。

4、鑒于腫瘤特異性抗原的稀缺性，迄今為止開發(fā)的絕大多數(shù)car均是針對腫瘤相關(guān)抗原的。因此，由中靶腫瘤外活性引起的頻繁和嚴(yán)重的副作用限制了它們的用途。雖然原則上它們應(yīng)該沒有副作用，但針對少數(shù)可用的腫瘤特異性抗原的car尚未有效。這種失敗至少部分是由于這些腫瘤特異性抗原的水平低和/或異質(zhì)表達(dá)。腫瘤細(xì)胞最終通過下調(diào)它們而逃逸，或者快速選擇不表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。為了利用腫瘤特異性抗原的特異性并將其與靶向腫瘤相關(guān)抗原的效力相結(jié)合，已開發(fā)表達(dá)雙特異性t細(xì)胞接合子的第四代car?t細(xì)胞，用作概念驗(yàn)證膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

5、編碼酪氨酸激酶受體her2的基因在所有腫瘤中有大約3％被擴(kuò)增。在一些腫瘤中，諸如影響乳腺和上胃腸道的那些腫瘤，her2擴(kuò)增的頻率達(dá)到～15％。這些腫瘤中的大約三分之一還表達(dá)截短形式的her2，稱為p95her2。雖然her2也在正常上皮中表達(dá)，盡管水平遠(yuǎn)低于her2擴(kuò)增的腫瘤，但p95her2是真正的腫瘤特異性抗原。一致地，我們先前已證明，特異性tcb有效地將淋巴細(xì)胞重定向至p95her2陽性乳腺腫瘤，但不靶向表達(dá)正常水平her2的細(xì)胞。

6、已生成幾種靶向p95her2的第二代car。這些car已被證明在體外和體內(nèi)對細(xì)胞系非常有效，但對患者來源的腫瘤異種移植物具有部分作用，表明它們在臨床上的功效有限。因此，鑒于目前細(xì)胞療法的局限性，需要car或雙特異性t細(xì)胞接合子替代品，以利用p95her2靶向的特異性和her2靶向的更廣泛作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開了靶向p95her2的裝甲car免疫細(xì)胞，為了增強(qiáng)其抗腫瘤治療作用，已對其進(jìn)行進(jìn)一步修飾，使其能夠分泌募集免疫細(xì)胞以靶向her2的雙特異性t細(xì)胞接合子(bite)。預(yù)期這種分泌her2雙特異性t細(xì)胞接合子的p95her2?car將組合靶向p95her2的特異性(因此具有安全性)與局部靶向her2的效力。

2、換言之，本發(fā)明利用腫瘤中異質(zhì)表達(dá)的腫瘤特異性抗原(p95her2)，以安全地觸發(fā)更豐富抗原的局部靶向，但其也在正常組織(her2)中表達(dá)。本發(fā)明顯著提高了先前描述的第二代p95her2?car免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用，并且將可能避免靶向her2的療法中典型腫瘤外副作用。

3、因此，本發(fā)明的第一方面涉及免疫細(xì)胞，其表達(dá)

4、(i)嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括：

5、οp95her2特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

6、ο跨膜結(jié)構(gòu)域和

7、ο至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/或共刺激結(jié)構(gòu)域

8、以及

9、(ii)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括：

10、ο與her2特異性結(jié)合的第一抗原結(jié)合區(qū)和

11、ο與cd3特異性結(jié)合的第二抗原結(jié)合區(qū)。

12、本發(fā)明的另外的方面涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括

13、(i)編碼嵌合抗原受體的第一區(qū)，所述嵌合抗原受體包括：

14、οp95her2特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

15、ο跨膜結(jié)構(gòu)域和

16、ο至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/或共刺激結(jié)構(gòu)域

17、以及

18、(ii)編碼雙特異性抗體的第二區(qū)，所述雙特異性抗體包括：

19、ο與her2特異性結(jié)合的第一抗原結(jié)合區(qū)和

20、ο與cd3特異性結(jié)合的第二抗原結(jié)合區(qū)；

21、或核酸組合物，所述核酸組合物包括

22、(i)編碼嵌合抗原受體的第一多核苷酸，所述嵌合抗原受體包括：

23、οp95her2特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

24、ο跨膜結(jié)構(gòu)域和

25、ο至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/或共刺激結(jié)構(gòu)域

26、以及

27、(ii)編碼雙特異性抗體的第二多核苷酸，所述雙特異性抗體包括：

28、ο與her2特異性結(jié)合的第一抗原結(jié)合區(qū)和

29、ο與cd3特異性結(jié)合的第二抗原結(jié)合區(qū)；

30、本發(fā)明的另一方面涉及載體或載體組合物，所述載體包含根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，所述載體組合物包括載體，其中，所述組合物的第一和第二核酸存在于不同的載體中。

31、本發(fā)明的又另一方面涉及由根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體編碼的多肽。

32、還一方面涉及用于獲得細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞表達(dá)

33、(i)嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括：

34、οp95her2特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

35、ο跨膜結(jié)構(gòu)域和

36、ο至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/或共刺激結(jié)構(gòu)域

37、以及

38、(ii)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括：

39、ο與her2特異性結(jié)合的第一抗原結(jié)合區(qū)和

40、ο與cd3特異性結(jié)合的第二抗原結(jié)合區(qū)；

41、所述方法包括將根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸組合物或根據(jù)本發(fā)明的載體或載體組合物插入細(xì)胞中。

技術(shù)特征：

1.一種免疫細(xì)胞，所述免疫細(xì)胞表達(dá)

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞，其中，所述雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合區(qū)和第二抗原結(jié)合區(qū)是scfv。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫細(xì)胞，其中：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫細(xì)胞，其中：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫細(xì)胞，其中：

6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞，其中，所述第一抗原結(jié)合區(qū)的scfv的vh和vl區(qū)、所述第二抗原結(jié)合區(qū)的scfv的vh和vl區(qū)和/或所述第一抗原結(jié)合區(qū)和第二抗原結(jié)合區(qū)的scfv通過肽接頭連接。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫細(xì)胞，其中，所述接頭選自seq?id?no:33、34或35。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫細(xì)胞，其中

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫細(xì)胞，其中，所述雙特異性抗體具有seq?id?no:38或seqid?no:107的序列。

10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car的p95her2特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是scfv。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car?scfv的vh區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3分別包括seq?id?no:39、40和41的序列和/或所述car?scfv的vl區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3分別包括seq?id?no:42、43和44的序列。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car的vh區(qū)的fr1、fr2、fr2和fr4分別包括seq?id?no:45、46、47和48的序列和/或所述car的vl區(qū)的fr1、fr2、fr3和fr4分別包括seq?id?no:49、50、51和52的序列或其功能等效的變體。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car?scfv的vh和vl區(qū)通過接頭區(qū)連接。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的免疫細(xì)胞，其中，所述接頭區(qū)包括seq?id?no:53。

15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car?scfv的vl包括seq?id?no:54的序列，并且所述car?scfv的vh包括seq?id?no:55的序列。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car?scfv包括seq?id?no:56的序列。

17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car的跨膜結(jié)構(gòu)域選自由以下組成的組：cd4跨膜結(jié)構(gòu)域、cd8跨膜結(jié)構(gòu)域、cd28跨膜結(jié)構(gòu)域、4-1bb跨膜結(jié)構(gòu)域、ctla4跨膜結(jié)構(gòu)域、cd27跨膜結(jié)構(gòu)域和cd3ζ跨膜結(jié)構(gòu)域。

18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的免疫細(xì)胞，其中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域包括seq?id?no:57的序列。

19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car的至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括共刺激結(jié)構(gòu)域、初級信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或其任何組合。

20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的免疫細(xì)胞，其中，所述至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括選自以下的共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap?12和4-1bb(cd137)或其任何組合。

21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫細(xì)胞，其中，所述共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括seqid?no:58的序列。

22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car的至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包括seq?id?no:59的序列。

23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的免疫細(xì)胞，其中，所述至少一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域相對于所述cd3ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域排列在n-末端側(cè)。

24.根據(jù)前述權(quán)利要求22所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car進(jìn)一步包括所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述跨膜結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。

25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫細(xì)胞，其中，所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域包括seq?id?no:60(cd8鉸鏈結(jié)構(gòu)域)的序列。

26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的免疫細(xì)胞，其中，所述car包括seq?id?no:61的序列。

27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞，用于醫(yī)藥的用途。

28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞，用于預(yù)防或治療癌癥方法的用途。

29.根據(jù)權(quán)利要求28所述用途的免疫細(xì)胞，其中，所述癌癥呈p95her2陽性。

30.一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括

31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物，其中，所述p95her2特異性car抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述car跨膜結(jié)構(gòu)域、所述至少一個car細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/或car共刺激結(jié)構(gòu)域、所述雙特異性抗體的抗her2抗原結(jié)合區(qū)和抗cd3抗原結(jié)合區(qū)如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所限定。

32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物，其中，由所述核酸構(gòu)建體的第一區(qū)或所述核酸組合物的第一多核苷酸編碼的嵌合抗原受體和由所述核酸構(gòu)建體的第二區(qū)或所述核酸組合物的第二多核苷酸編碼的雙特異性抗體進(jìn)一步包括信號序列。

33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物，其中，形成所述嵌合抗原受體的一部分的信號序列包括seq?id?no:62和/或其中，形成所述雙特異性抗體的一部分的信號序列包括seq?id?no:63。

34.根據(jù)權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其是多順反子構(gòu)建體，其中，由所述第一區(qū)編碼的嵌合抗原受體和由所述第二區(qū)編碼的雙特異性抗體位于同一開放閱讀框中并由自切割肽區(qū)分隔開。

35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述自切割肽區(qū)包括seqid?no:64的序列。

36.根據(jù)權(quán)利要求31至35中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物，其中，由所述核酸構(gòu)建體的第一區(qū)或所述核酸組合物的第一多核苷酸編碼的嵌合抗原受體和/或由所述核酸構(gòu)建體的第二區(qū)或所述核酸組合物的第二多核苷酸編碼的雙特異性抗體進(jìn)一步包含標(biāo)簽。

37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物，其中，所述標(biāo)簽位于所述雙特異性抗體的c-末端。

38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物，其中，所述標(biāo)簽是六組氨酸標(biāo)簽。

39.一種由權(quán)利要求31至38中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體編碼的多肽。

40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的多肽，所述多肽包括seq?id?no:65、或seq?id?no:66、或seqid?no:108或seq?id?no:109的序列。

41.一種載體或載體組合物，所述載體包含根據(jù)權(quán)利要求31至38中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，所述載體組合物包括載體，其中，所述組合物的第一和第二核酸存在于不同的載體中。

42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的載體或載體組合物，其中，所述核酸構(gòu)建體、所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸在鼠干細(xì)胞病毒(mscv)長末端重復(fù)序列的操作控制下。

43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的載體或載體組合物，其中，所述載體是慢病毒載體。

44.根據(jù)權(quán)利要求31至38中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物或者根據(jù)權(quán)利要求41至43中任一項(xiàng)所述的載體或載體組合物，用于醫(yī)藥的用途。

45.根據(jù)權(quán)利要求31至38中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體或核酸組合物或者根據(jù)權(quán)利要求41至43中任一項(xiàng)所述的載體或載體組合物，用于預(yù)防或治療癌癥的方法的用途。

46.根據(jù)權(quán)利要求45所述用途的核酸構(gòu)建體、核酸組合物、載體或載體組合物，其中，所述癌癥呈p95her2陽性。

47.一種用于獲得細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞表達(dá)

48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述細(xì)胞是來自免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。

49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述來自免疫系統(tǒng)的細(xì)胞是t細(xì)胞、nk細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及表達(dá)針對p95HER2的嵌合抗原受體以及針對HER2和CD3的雙特異性抗體的免疫細(xì)胞及其在治療癌癥(特別是過表達(dá)p95HER2的癌癥)中的用途。

技術(shù)研發(fā)人員：華金·阿里瓦斯·洛佩斯,馬卡雷納·羅馬·阿隆索,阿里亞德娜·格林尼奧·艾·埃斯庫埃爾,圣地亞哥·杜羅·桑切斯,伊雷妮·里烏斯·魯伊斯,瓦妮莎·諾加萊斯·特拉列羅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：瓦爾希伯倫私人腫瘤研究基金會
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6