本公開總體上涉及經(jīng)修飾的抗體和其用途。

背景技術：

1、目前，單克隆抗體已被用作特異性和有效的生物藥物，所述生物藥物可以顯示出對單個靶抗原的出色特異性。然而，對于一些情況，對兩種(或更多種)不同靶抗原具有特異性的單個抗體——通常被稱為雙特異性抗體(或多特異性抗體)，是優(yōu)選的。雙特異性或多特異性抗體可以同時識別兩種或更多種不同的抗原，中和不同的致病性介體，募集不同類型的效應細胞并且調(diào)節(jié)信號通路，這使它們在許多方面優(yōu)于單特異性抗體。在此類情況下，開發(fā)雙特異性或多特異性抗體作為人類疾病的治療劑具有重要的臨床顯著性，并且雙特異性抗體近年來已經(jīng)成為診斷和治療應用中廣泛使用的形式。

2、然而，雙特異性或多特異性抗體的產(chǎn)生仍具挑戰(zhàn)性。在雙特異性抗體的情況下，對一種抗原具有特異性的重鏈必須與對同一抗原具有特異性的輕鏈配對。如果重鏈與對其它不同抗原具有特異性的輕鏈配對，那么預期的抗原特異性可能被破壞或降低。因為仍然不可能很好地控制輕鏈與具有天然igg結構的對應重鏈之間的正確配對，所以將另外的抗體特異性引入到單個抗體的努力經(jīng)常引起錯誤組裝抗體的產(chǎn)生。

3、仍然需要產(chǎn)生具有多于一種特異性的新型經(jīng)修飾的抗體。

技術實現(xiàn)思路

1、一方面，本公開提供了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括第一臂和第二臂，所述第一臂由第一重鏈和第一輕鏈以及在其間形成的鏈間二硫鍵形成，所述第二臂由第二重鏈和第二輕鏈以及在其間形成的鏈間二硫鍵形成，其中所述第一重鏈上的至少一個非半胱氨酸殘基被半胱氨酸取代，其中所述非半胱氨酸殘基位于選自由以下組成的組的位置處：所述第一重鏈的氨基酸位置126、128、129、136、141、168、170、173、175或187；并且所述第一輕鏈上的至少一個非半胱氨酸殘基被半胱氨酸取代，其中所述非半胱氨酸殘基位于選自由以下組成的組的位置處：所述第一輕鏈的氨基酸位置114、116、118、124、135、137、138、160、162或164。

2、在一些實施方式中，所述第一重鏈上被半胱氨酸取代的所述至少一個非半胱氨酸殘基選自由以下組成的組：所述第一重鏈的氨基酸殘基f126、l128、a129、s136、a141、h168、f170、v173、q175或t187；并且所述第一輕鏈上被半胱氨酸取代的所述至少一個非半胱氨酸殘基選自由以下組成的組：所述第一輕鏈的氨基酸殘基s114、f116、f118、q124、l135、n137、n138、q160、s162或t164。

3、在一些實施方式中，所述第一輕鏈和所述第一重鏈包括所述第一輕鏈上的天然半胱氨酸和所述第一重鏈上的天然半胱氨酸的至少一個非半胱氨酸取代對以及至少一個選自由以下組成的組的半胱氨酸取代對：(i)位于輕鏈上的s114c和位于重鏈上的s136c；(ii)位于輕鏈上的f116c和位于重鏈上的s136c；(iii)位于輕鏈上的f118c和位于重鏈上的l128c；(iv)位于輕鏈上的f118c和位于重鏈上的a129c；(v)位于輕鏈上的f118c和位于重鏈上的a141c；(vi)位于輕鏈上的q124c和位于重鏈上的f126c；(vii)位于輕鏈上的l135c和位于重鏈上的f170c；(viii)位于輕鏈上的n137c和位于重鏈上的f170c；(ix)位于輕鏈上的n138c和位于重鏈上的h168c；(x)位于輕鏈上的q160c和位于重鏈上的v173c；(xi)位于輕鏈上的q160c和位于重鏈上的q175c；(xii)位于輕鏈上的s162c和位于重鏈上的f170c；(xiii)位于輕鏈上的s162c和位于重鏈上的t187c；以及(xiv)位于輕鏈上的t164c和位于重鏈上的f170c；其中所述至少一個半胱氨酸取代對在所述第一重鏈與所述第一輕鏈之間形成至少一個鏈間二硫鍵；其中所述第一重鏈和所述第一輕鏈上的所述天然半胱氨酸獨立地被非半胱氨酸殘基中的任一者取代。

4、在一些實施方式中，所述第一重鏈和所述第一輕鏈上的所述天然半胱氨酸獨立地被絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸或纈氨酸中的任一者取代。在一些實施方式中，待取代的所述天然半胱氨酸是所述抗體的輕鏈中的氨基酸殘基c214和重鏈中的氨基酸殘基c220。在一些實施方式中，所述第一輕鏈包括突變c214s，并且所述第一重鏈包括突變c220s。

5、在一些實施方式中，所述第一重鏈和所述第一輕鏈包括一個半胱氨酸取代對。在一些實施方式中，所述第一重鏈和所述第一輕鏈包括兩個半胱氨酸取代對。

6、在一些實施方式中，所述兩個半胱氨酸取代對選自由以下組成的組：(i)位于輕鏈上的s114c/q160c和位于重鏈上的s136c/v173c；(ii)位于輕鏈上的f118c/q124c和位于重鏈上的l128c/f126c；(iii)位于輕鏈上的f118c/q124c和位于重鏈上的a129c/f126c；(iv)位于輕鏈上的f118c/q124c和位于重鏈上的a141c/f126c；(v)位于輕鏈上的f116c/q124c和位于重鏈上的s136c/f126c；(vi)位于輕鏈上的q124c/t164c和位于重鏈上的f126c/f170c；(vii)位于輕鏈上的q124c/n138c和位于重鏈上的f126c/h168c；(viii)位于輕鏈上的q160c/l135c和位于重鏈上的q175c/f170c；(ix)位于輕鏈上的s114c/s162c和位于重鏈上的s136c/f170c；(x)位于輕鏈上的f118c/s162c和位于重鏈上的l128c/f170c；(xi)位于輕鏈上的f118c/s162c和位于重鏈上的a141c/f170c；(xii)位于輕鏈上的q124c/s162c和位于重鏈上的f126c/f170c；(xiii)位于輕鏈上的n137c/s162c和位于重鏈上的f170c/t187c。

7、在一些實施方式中，所述第一輕鏈包括突變q124c/t164c/c214s，并且所述第一重鏈包括突變f126c/f170c/c220s。在一些實施方式中，所述第一輕鏈包括突變q124c/s162c/c214s，并且所述第一重鏈包括突變f126c/f170c/c220s。

8、在一些實施方式中，所述第二重鏈與所述第二輕鏈之間的二硫鍵在所述第二輕鏈上的天然半胱氨酸與所述第二重鏈上的天然半胱氨酸之間形成；其中所述天然半胱氨酸在所述第二輕鏈上的位置與人κ鏈上的位置c214相對應，并且所述天然半胱氨酸在所述第二重鏈上的位置與人igg1上的位置c220相對應。

9、在一些實施方式中，所述第二輕鏈和所述第二重鏈包括至少一個非半胱氨酸取代對，其中所述輕鏈上的天然半胱氨酸取代為絲氨酸和所述重鏈上的天然半胱氨酸取代為絲氨酸，以及至少一個選自由以下組成的組的半胱氨酸取代對：(i)位于輕鏈上的s114c和位于重鏈上的s136c；(ii)位于輕鏈上的f116c和位于重鏈上的s136c；(iii)位于輕鏈上的f118c和位于重鏈上的l128c；(iv)位于輕鏈上的f118c和位于重鏈上的a129c；(v)位于輕鏈上的f118c和位于重鏈上的a141c；(vi)位于輕鏈上的q124c和位于重鏈上的f126c；(vii)位于輕鏈上的l135c和位于重鏈上的f170c；(viii)位于輕鏈上的n137c和位于重鏈上的f170c；(ix)位于輕鏈上的n138c和位于重鏈上的h168c；(x)位于輕鏈上的q160c和位于重鏈上的v173c；(xi)位于輕鏈上的q160c和位于重鏈上的q175c；(xii)位于輕鏈上的s162c和位于重鏈上的f170c；(xiii)位于輕鏈上的s162c和位于重鏈上的t187c；以及(xiv)位于輕鏈上的t164c和位于重鏈上的f170c；其中所述至少一個半胱氨酸取代對在所述第二輕鏈與所述第二重鏈之間形成至少一個鏈間二硫鍵，并且所述第一臂上的所述半胱氨酸取代對不同于所述第二臂上的所述半胱氨酸取代對。非半胱氨酸取代對是指一對已經(jīng)突變成非半胱氨酸的氨基酸的天然半胱氨酸(一個位于輕鏈上，并且一個位于重鏈上)。半胱氨酸取代對是指一對已經(jīng)突變成半胱氨酸的天然非半胱氨酸氨基酸(一個位于輕鏈上，并且一個位于重鏈上)。

10、在一些實施方式中，所述第二輕鏈上取代的天然半胱氨酸位于所述人κ鏈上的位置c214處，并且所述第二重鏈上取代的天然半胱氨酸位于所述人igg1上的位置c220處。

11、在一些實施方式中，所述第二重鏈和所述第二輕鏈包括兩個半胱氨酸取代對。在一些實施方式中，所述兩個半胱氨酸取代對選自由以下組成的組：(i)位于輕鏈上的s114c/q160c和位于重鏈上的s136c/v173c；(ii)位于輕鏈上的f118c/q124c和位于重鏈上的l128c/f126c；(iii)位于輕鏈上的f118c/q124c和位于重鏈上的a129c/f126c；(iv)位于輕鏈上的f118c/q124c和位于重鏈上的a141c/f126c；(v)位于輕鏈上的f116c/q124c和位于重鏈上的s136c/f126c；(vi)位于輕鏈上的q124c/t164c和位于重鏈上的f126c/f170c；(vii)位于輕鏈上的q124c/n138c和位于重鏈上的f126c/h168c；(viii)位于輕鏈上的q160c/l135c和位于重鏈上的q175c/f170c；(ix)位于輕鏈上的s114c/s162c和位于重鏈上的s136c/f170c；(x)位于輕鏈上的f118c/s162c和位于重鏈上的l128c/f170c；(xi)位于輕鏈上的f118c/s162c和位于重鏈上的a141c/f170c；(xii)位于輕鏈上的q124c/s162c和位于重鏈上的f126c/f170c；以及(xiii)位于輕鏈上的n137c/s162c和位于重鏈上的f170c/t187c；其中所述第一臂上的所述半胱氨酸取代對不同于所述第二臂上的所述半胱氨酸取代對。

12、在一些實施方式中，第一重鏈恒定區(qū)和/或第二重鏈恒定區(qū)包括人igg1、igg2、igg3或igg4；并且第一輕鏈恒定區(qū)和/或第二輕鏈恒定區(qū)包括人κ輕鏈或人λ輕鏈。

13、在一些實施方式中，所述第一重鏈和所述第二重鏈形成異二聚體；并且所述第一重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)和/或所述第二重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)包括一個或多個促進異二聚體化的修飾。

14、在一些實施方式中，所述第一重鏈的fc區(qū)通過杵/臼(knob/hole)結構與所述第二重鏈的fc區(qū)相互作用。在一些實施方式中，所述第一重鏈的fc區(qū)包括杵(knob)突變，并且所述第二重鏈的fc區(qū)包括臼(hole)突變；或者所述第一重鏈的fc區(qū)包括臼突變，并且所述第二重鏈的fc區(qū)包括杵突變。在一些實施方式中，所述杵突變包括t366w，并且所述臼突變包括t366s/l368a/y407v。

15、在一些實施方式中，所述促進異二聚體化的修飾包括引入能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基。

16、在一些實施方式中，所述第一重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)和所述第二重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)分別包括ch3區(qū)中的修飾；其中兩個ch3區(qū)中的所述修飾選自以下：

17、 一個ch3區(qū)中的修飾 另一個ch3區(qū)中的修飾 t366s/l368a/y407v t366w s354c/t366w y349c/t366s/l368a/y407v t366y y407t t366w y407a t394w f405a t366y/f405a t394w/y407t t366w/f405w t394s/y407a f405w t394s d399c k392c t366w/d399c t366s/l368a/k392c/y407v t366w/k392c t366s/l368a/d399c/y407v s354c/t366w y349c/t366s/l368a/y407v y349c/t366w s354c/t366s/l368a/y407v e356c/t366w y349c/t366s/l368a/y407v y349c/t366w e356c/t366s/l368a/y407v e357c/t366w y349c/t366s/l368a/y407v y349c/t366w e357c/t366s/l368a/y407v

18、在一些實施方式中，所述第一重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)和所述第二重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)分別包括ch3區(qū)中的修飾；其中兩個ch3區(qū)中的所述修飾選自以下：

19、 一個ch3區(qū)中的修飾 另一個ch3區(qū)中的修飾 k370e/d399k/k439d d356k/e357k/k409d k409d d399k k409e d399k k409e d399r k409d d399r d339k e356k e356k/d399k k392d/k409d e356k/d399k k409d/k439d e357k/d399k k370d/k409d d399k/e357k/e356k k370d/k392d/k409d e357k/d399k k392d/k409d k392d/k409d d399k k360d/k409d d399k

20、在一些實施方式中，所述第一臂和所述第二臂可以與選自由以下組成的組的抗原特異性結合：sirpα、cldn18.2、siglec15、her2、egfr、cd19、cd20、cd39、cd47、pd1、pdl1、cd3、nkg2d、nkg2a、nkp46、cd137、ox40、cd40、lilrb1、lilrb2、lilrb4、gpc3、trop2、cd112、tigit、fap、vegfa、dll4、ang-2，其中所述第一臂和所述第二臂可以與不同的抗原特異性結合。

21、在一些實施方式中，所述第一重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)和/或所述第二重鏈恒定區(qū)的fc區(qū)進一步包括改善所述抗體或所述抗原結合片段的穩(wěn)定性的修飾。

22、在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是人源化抗體或嵌合抗體。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是雙特異性抗體或多特異性抗體。

23、在一些實施方式中，所述抗體或所述抗原結合片段連接于一個或多個綴合物部分。

24、在一些實施方式中，所述綴合物部分包括第二抗體片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段包括fab片段，所述fab片段連接于所述第二抗體片段的fc區(qū)的c末端。

25、在一些實施方式中，所述綴合物部分包括用于檢測或分離的藥劑，如清除改性劑、發(fā)光標記、熒光標記、酶底物標記或純化部分。在一些實施方式中，所述綴合物部分包括治療劑或藥物。

26、一方面，本公開提供了一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼本文所公開的抗體或其抗原結合片段。

27、一方面，本公開提供了一種載體，所述載體包括本文所公開的分離的多核苷酸。

28、一方面，本公開提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包括本文所公開的載體。

29、一方面，本公開提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：(i)抗體或其抗原結合片段或本文所公開的多核苷酸；以及(ii)一種或多種藥學上可接受的載體。

30、一方面，本公開提供了一種表達本文所公開的抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在適于表達其中包含的載體的條件下培養(yǎng)本文所公開的宿主細胞。

31、一方面，本公開提供了一種在受試者中治療、預防或減輕疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的抗體或其抗原結合片段、或編碼所述抗體或其抗原結合片段的多核苷酸、或載體、或宿主細胞或本文所公開的藥物組合物。

32、在一些實施方式中，所述受試者是人。在一些實施方式中，所述施用是經(jīng)口服、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)、皮下、舌下或肌內(nèi)施用的。

33、一方面，本公開提供了一種抗體或其抗原結合片段、或編碼所述抗體或其抗原結合片段的多核苷酸、或載體、或宿主細胞或本文所公開的藥物組合物在制備用于在受試者中治療、預防或減輕疾病的藥物中的用途。