本發(fā)明涉及生物，具體涉及測(cè)序酶的高通量篩選體系和篩選方法。

背景技術(shù)：

1、fret是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)(供體donor)的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)(受體acceptor)吸收光譜有一定的重疊,當(dāng)兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。fret發(fā)光原理如下圖1，激發(fā)供體熒光并當(dāng)熒光供體分子和熒光受體分子距離足夠靠近，即可發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)受體發(fā)光的現(xiàn)象，再通過(guò)熒光捕捉器，如酶標(biāo)儀，進(jìn)行熒光檢測(cè)：

2、fret發(fā)生條件：

3、1)能量匹配：供體分子的發(fā)射光譜可以被受體分子吸收并產(chǎn)生熒光信號(hào)。供體分子的發(fā)射光譜與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊(>30％)；

4、2)作用距離：供體分子與受體分子的作用距離為1～10nm；

5、3)fret效率公式：用于計(jì)算分子/基團(tuán)間作用距離r

6、

7、r0＝const·κ2·n-4·φd·jda

8、4)偶極-偶極作用：供體分子與受體分子作用時(shí)的向量必須滿(mǎn)足一定條件。

9、fret技術(shù)應(yīng)用范圍廣泛，從技術(shù)發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)有25年的歷史，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域及生物化學(xué)領(lǐng)域。通過(guò)fret技術(shù)可以獲得有關(guān)兩個(gè)蛋白分子之間相互作用的空間信息(作用距離、作用方向、能量傳遞效率)。常用于解決如下問(wèn)題：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合體；轉(zhuǎn)錄機(jī)制；轉(zhuǎn)化途徑；分子運(yùn)動(dòng)；蛋白折疊等生物學(xué)問(wèn)題。

10、傳統(tǒng)的方法檢測(cè)單堿基摻入dna鏈的實(shí)驗(yàn)一般要通過(guò)電泳分析查看，耗時(shí)較長(zhǎng)，通量較低，需要更高的時(shí)間和更大的成本；而且，電泳分析方法只能通過(guò)終點(diǎn)法來(lái)查看單堿基的摻入情況，無(wú)法實(shí)時(shí)檢測(cè)單堿基摻入的情況，因此通過(guò)電泳方法評(píng)估酶對(duì)單堿基摻入dna鏈的速度、效率以及催化活性或進(jìn)行高活性測(cè)序酶篩選時(shí)會(huì)耗時(shí)耗力。測(cè)序酶篩選技術(shù)的第一版，雖然也是使用能量共振轉(zhuǎn)移(fret)技術(shù)，但是由于操作流程繁雜，也沒(méi)有搭載自動(dòng)工作站，因此無(wú)法進(jìn)行高通量篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于用于dna操作的酶的高通量篩選體系和篩選方法。

2、本發(fā)明提供了核苷酸類(lèi)似物，其具有如下式(i)所示結(jié)構(gòu)：

3、

4、其中，

5、blocker為阻斷基團(tuán)；

6、p為三磷酸基團(tuán)；

7、x為含氮堿基，所述含氮堿基選自腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一種；

8、y為多肽；

9、r為-oh或-h；

10、優(yōu)選的，阻斷基團(tuán)blocker的結(jié)構(gòu)如下所示：

11、

12、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的核苷酸類(lèi)似物具有如式(ii)所示結(jié)構(gòu)：

13、本發(fā)明所述的核苷酸類(lèi)似物，其可包括脫氧核糖核苷酸類(lèi)似物和/或核糖核苷酸類(lèi)似物；所述脫氧核糖核苷酸類(lèi)似物可摻入dna鏈，對(duì)dna鏈的合成和dna聚合酶發(fā)揮作用不產(chǎn)生干擾；所述核糖核苷酸類(lèi)似物可摻入rna單鏈，對(duì)rna的合成和rna聚合酶活性不產(chǎn)生干擾。

14、本發(fā)明提供了測(cè)序酶篩選體系，其包括連接有第一檢測(cè)基團(tuán)的核苷酸類(lèi)似物、連接有第二檢測(cè)基團(tuán)的模板dna和dna聚合酶。

15、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的測(cè)序酶篩選體系中，

16、所述模板dna的3’末端和/或5’末端連接有第二檢測(cè)基團(tuán)；

17、所述模板dna具有3’單鏈區(qū)或5’單鏈區(qū)中的至少一種和中部雙鏈區(qū)；

18、本發(fā)明的一些實(shí)施例中，

19、所述模板dna的3’末端連接有第二檢測(cè)基團(tuán)；

20、所述模板dna的5’末端連接有第二檢測(cè)基團(tuán)；

21、所述模板dna的3’末端和5’末端均連接有第二檢測(cè)基團(tuán)。

22、本發(fā)明中，所述模板dna可以具有3’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)，也可具有5’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)，也可以具有3’單鏈區(qū)、5’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)。

23、進(jìn)一步的，本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述模板dna具有3’單鏈區(qū)、5’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)。

24、本發(fā)明所述模板dna的3’單鏈區(qū)或5’單鏈區(qū)用于在dna聚合酶的作用下將核苷酸摻入dna鏈，隨后根據(jù)摻入速度評(píng)價(jià)聚合酶效率；所述3’單鏈區(qū)，5’單鏈區(qū)可同時(shí)存在，也可只存在一種，對(duì)檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生影響；并且所述3’單鏈區(qū)和5’單鏈區(qū)的核苷酸序列組成對(duì)檢測(cè)結(jié)果也不產(chǎn)生影響；dna模板可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員需求進(jìn)行替換。

25、但本發(fā)明所述的模板dna設(shè)計(jì)適合本發(fā)明所述篩選體系，其合成簡(jiǎn)單，篩選方便，用料節(jié)約。

26、本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述模板dna的3’單鏈區(qū)和5’單鏈區(qū)的核苷酸序列相反。

27、本發(fā)明中，所述模板dna也可以通過(guò)兩條3’端序列相同或不同，5’端序列反向互補(bǔ)的引物退火制成；所述5’端核苷酸的數(shù)目≥3’端核苷酸數(shù)目。

28、本發(fā)明中，所述第一檢測(cè)基團(tuán)發(fā)射光譜與第二檢測(cè)基團(tuán)的吸收光譜有重疊。

29、進(jìn)一步的，所述第一檢測(cè)基團(tuán)發(fā)射光譜與第二檢測(cè)基團(tuán)的吸收光譜具有≥30的重疊。

30、具體的，所述第一檢測(cè)基團(tuán)和第二檢測(cè)基團(tuán)可以包括如下所示中的任意一種組合：

31、第一檢測(cè)基團(tuán)為b-phycoerythrin；第二檢測(cè)基團(tuán)為cy5；或

32、第一檢測(cè)基團(tuán)為rhodamine?6g；第二檢測(cè)基團(tuán)為cy5；或

33、第一檢測(cè)基團(tuán)為gfp；第二檢測(cè)基團(tuán)為yfp；或

34、第一檢測(cè)基團(tuán)為cy3；第二檢測(cè)基團(tuán)為cy5；或

35、第一檢測(cè)基團(tuán)為fluorescein；第二檢測(cè)基團(tuán)為tetramethylrhodamine；或

36、第一檢測(cè)基團(tuán)為cfp；第二檢測(cè)基團(tuán)為gfp；或

37、第一檢測(cè)基團(tuán)為bfp；第二檢測(cè)基團(tuán)為dsrfp；或

38、第一檢測(cè)基團(tuán)為tryptophan；第二檢測(cè)基團(tuán)為dansyl。

39、更一步的，本發(fā)明中，

40、所述第一檢測(cè)基團(tuán)為cy3；

41、所述第二檢測(cè)基團(tuán)為cy5。

42、本發(fā)明提供了試劑盒，其包括輔料和如下i)～ii)所示中的至少一種：

43、i)、本發(fā)明所述的核苷酸類(lèi)似物；

44、ii)、本發(fā)明所述的測(cè)序酶篩選體系。

45、進(jìn)一步的，所述輔料為生物技術(shù)領(lǐng)域常用的固體或液體試劑或其組合；

46、更進(jìn)一步的，所述輔料包括裂解液、清洗液、純化試劑或緩沖液中的一種或兩種以上的組合。

47、本發(fā)明提供了測(cè)序酶的篩選方法，其包括：利用如本發(fā)明所述的核苷酸類(lèi)似物和/或如本發(fā)明所述的測(cè)序酶篩選體系和/或如本發(fā)明所述的試劑盒對(duì)測(cè)序酶進(jìn)行篩選。

48、進(jìn)一步的，所述的篩選方法包括如下步驟：

49、將連接有第一檢測(cè)基團(tuán)的核苷酸類(lèi)似物、核苷酸、連接有第二檢測(cè)基團(tuán)的模板dna、測(cè)序酶、緩沖液和水的混合物進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)信號(hào)隨時(shí)間變化的活性曲線獲得單堿基的摻入速率后對(duì)所述dna聚合酶進(jìn)行篩選；

50、所述核苷酸包括與核苷酸類(lèi)似物具有不同含氮堿基的核苷酸的混合物。

51、本發(fā)明所述的篩選方法中，

52、所述核苷酸類(lèi)似物的濃度為0.25μm；

53、所述核苷酸的濃度為0.25μm；

54、所述連接有第二檢測(cè)基團(tuán)的模板dna的濃度為0.1μm；

55、所述測(cè)序酶的濃度為0.5mg/ml。

56、本發(fā)明所述的篩選方法中，

57、所述反應(yīng)的條件為溫度40℃反應(yīng)2h；

58、所述檢測(cè)的條件為：激發(fā)波長(zhǎng)為530nm、發(fā)射波長(zhǎng)為568nm和676nm；每1～3min檢測(cè)一次；

59、所述單堿基的摻入速率為所述活性曲線的斜率。

60、本發(fā)明所述的篩選方法也可以在正常dna鏈或rna鏈的情況下，通過(guò)普通pcr的預(yù)變性、退火、延伸的程序進(jìn)行。

61、本發(fā)明所述的測(cè)序酶經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得，所述誘導(dǎo)表達(dá)的步驟可借助于自動(dòng)化設(shè)備也可手動(dòng)完成；本發(fā)明中所述的誘導(dǎo)表達(dá)借助于tecan自動(dòng)工作站完成，在可達(dá)到后續(xù)檢測(cè)要求的前提下利用自動(dòng)化儀器設(shè)備完成測(cè)序酶的小體積培養(yǎng)和快速生產(chǎn)，有利于縮短進(jìn)程、節(jié)約時(shí)間和成本。

62、本發(fā)明提供了如下i)～iv)所示中的至少一種在制備測(cè)序酶篩選產(chǎn)品、測(cè)序酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)試、評(píng)估沒(méi)得催化活性和/或評(píng)估酶對(duì)堿基摻入模板鏈的速度、效率中的應(yīng)用：

63、i)、本發(fā)明所述的核苷酸類(lèi)似物；

64、ii)、本發(fā)明所述的測(cè)序酶篩選體系；

65、iii)、本發(fā)明所述的試劑盒；

66、iv)、本發(fā)明所述的篩選方法。

67、進(jìn)一步的，所述測(cè)序酶包括dna聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、加尾酶或rna聚合酶中的至少一種。

68、本發(fā)明所述的篩選方法可對(duì)測(cè)序酶篩選產(chǎn)品的性能進(jìn)行評(píng)估。

69、本發(fā)明將熒光對(duì)cy3和cy5分別連接在dna模板鏈和datp上，構(gòu)建了dna聚合酶篩選體系，在借助于自動(dòng)化平臺(tái)和酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了dna聚合酶對(duì)修飾單堿基摻入dna鏈的速度、效率以及催化活性的評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的篩選體系和配套的篩選方法可實(shí)現(xiàn)dna聚合酶的高通量篩選，節(jié)約了篩選的時(shí)間，降低了篩選的成本，并且所述篩選體系和篩選方法可以應(yīng)用到其他相關(guān)項(xiàng)目中，具有廣泛的應(yīng)用前景。