本發(fā)明屬于醫(yī)藥，涉及一種角蛋白cf1，編碼角蛋白cf1的核酸分子，含有該核酸分子的表達載體，以及含有該表達載體或基因組整合該核酸分子的宿主細胞，以及角蛋白cf1的制備方法，含有這種角蛋白的藥物組合物，以及這種角蛋白和所述藥物組合物在制備解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰、抗驚厥、抗癲癇、降血壓、抗炎、抗病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、角蛋白是蛋白質(zhì)的一種，廣泛存在于人和動物的表皮，并且是毛發(fā)、羽毛、蹄、殼、爪、角等的主要成分，是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著保護機體的作用。

2、角蛋白廣泛存在于生物體中，是一種可再生資源，具有很大的利用價值，但并沒有得到廣泛有效的利用。主要原因是角蛋白不溶于各種溶劑，并且角蛋白一般都較其他蛋白質(zhì)更耐蛋白酶的酶解。因此提取制備天然角蛋白的難度非常大。

3、隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因工程、微生物工程等現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)。而利用蛋白表達系統(tǒng)制備生產(chǎn)目的蛋白是研究基因或蛋白的生物功能的重要手段。

4、利用蛋白表達系統(tǒng)制備目的角蛋白，進而研究其結(jié)構(gòu)與功能，未見其他文獻報道，具有新穎性和創(chuàng)造性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種角蛋白cf1，編碼角蛋白cf1的核酸分子，含有該核酸分子的表達載體，以及含有該表達載體或基因組整合該核酸分子的宿主細胞，以及角蛋白cf1的制備方法，含有角蛋白cf1的藥物組合物，以及上述角蛋白cf1、核酸分子、表達載體、宿主細胞、或藥物組合物在制備解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰、抗驚厥、抗癲癇、降血壓、抗炎、抗病毒藥物中的應(yīng)用。

2、為解決本發(fā)明的技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明技術(shù)方案的第一方面是提供了一種角蛋白cf1，其特征在于，所述角蛋白cf1的氨基酸序列為：

4、(1)序列表中seq?id?no.1所示的氨基酸序列；

5、(2)序列表中seq?id?no.1所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加1-35個氨基酸形成的基本上保持相同生物學(xué)功能的氨基酸序列。

6、進一步的，在角蛋白cf1上可進行常規(guī)修飾；或者在角蛋白cf1上還連接有用于檢測或純化的標簽。

7、更進一步的，所述的常規(guī)修飾包括乙酰化、酰胺化、環(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、熒光基團修飾、聚乙二醇peg修飾、固定化修飾、硫酸化、氧化、甲基化、脫氨化、形成二硫鍵或二硫鍵斷裂；所述的標簽包括his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc、profinity?exact。

8、本發(fā)明技術(shù)方案的第二方面是提供了一種編碼第一方面所述角蛋白cf1的核酸分子。

9、進一步的，所述的核酸分子的核苷酸序列為：

10、(1)序列表中seq?id?no.2所示的核苷酸序列；

11、(2)基于seq?id?no.2所示的核苷酸序列進行序列優(yōu)化得到的核苷酸序列；

12、(3)與上述(1)或(2)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。

13、本發(fā)明技術(shù)方案的第三方面是提供了一種表達載體，其特征在于，所述的表達載體含有第二方面所述的核酸分子。

14、進一步的，表達載體可以為pet系列、puc系列、pqe系列、pbv系列、pmal系列，ppic9、ppic9k、phil-s1、ppiczα/a、pyam75p，phil-d2、pa0815、ppic3k、ppicz、phwo10、pgapz、pgapza、ppic3.5k等；優(yōu)選的表達載體為pet系列載體；最優(yōu)選的表達載體為pet-28a(+)。

15、本發(fā)明技術(shù)方案的第四方面是提供了一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有第三方面所述的表達載體或者基因組中整合有第二方面所述的核酸分子。

16、進一步的，所述的宿主細胞包括細菌、酵母、曲霉菌、植物細胞、或昆蟲細胞。

17、更進一步的，所述的細菌包括大腸桿菌或酵母。

18、感受態(tài)宿主細胞可以為bl21系列，transetta系列，rosetta系列，dh5α系列，jm系列，top系列，orgami系列，trans1-t1，tg1，tb1；y11430，mg1003，gs115(aox1)，km71，smd1168等；優(yōu)選的表達感受態(tài)細胞為bl21(de3)，transetta(de3)。

19、本發(fā)明技術(shù)方案的第五方面是提供了一種制備第一方面所述角蛋白cf1的方法，其特征在于，包括以下步驟：

20、a.合成第一方面所述的角蛋白cf1對應(yīng)的核酸分子，將核酸分子連入相應(yīng)的表達載體，將表達載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞，在一定條件下在發(fā)酵設(shè)備中培養(yǎng)帶表達載體的宿主細胞并誘導(dǎo)表達角蛋白cf1，得到含有角蛋白cf1的粗蛋白溶液；

21、b.對步驟a中所表達的粗蛋白溶液進行分離純化干燥得到角蛋白cf1。

22、進一步的，在步驟a中，所述的宿主細胞主要為選自大腸桿菌，所述的角蛋白cf1在大腸桿菌包涵體中表達，所述的發(fā)酵設(shè)備包括搖瓶或發(fā)酵罐。

23、進一步的，在步驟a中，誘導(dǎo)表達角蛋白cf1后，可用清洗劑清洗雜質(zhì)，再用尿素溶液溶解得到粗蛋白溶液。

24、進一步的，步驟a中的培養(yǎng)基可以為lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基、sb培養(yǎng)基、sob培養(yǎng)基、soc培養(yǎng)基，pda培養(yǎng)基、ypd培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、doba培養(yǎng)基、米曲培養(yǎng)基及其改良配方等；搖瓶發(fā)酵優(yōu)選lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基，最優(yōu)選為tb培養(yǎng)基；發(fā)酵罐優(yōu)選lb培養(yǎng)基及其改良配方。

25、進一步的，步驟a中的誘導(dǎo)劑可以為iptg、乳糖、阿拉伯糖等；優(yōu)選為iptg、乳糖。

26、進一步的，步驟a中，獲得的發(fā)酵菌液，離心，棄去上清液；沉淀懸浮于緩沖液中，破碎菌體，再離心，棄去上清液；沉淀用清洗劑清洗后，再用尿素溶液溶解得到cf1粗蛋白溶液。

27、其中，緩沖液優(yōu)選為buffer?a，其用量為：發(fā)酵液體積：buffer?a體積＝1～100：1，優(yōu)選為10∶1；

28、清洗劑可以為尿素溶液、鹽酸胍溶液、triton、buffer?a等，優(yōu)選為尿素溶液，最優(yōu)選為2m尿素溶液(可含有1％triton)和4m尿素溶液，其用量為：發(fā)酵液體積∶尿素溶液體積＝0.2～100∶1，優(yōu)選為1～15∶1；

29、尿素溶液優(yōu)選為4m～8m尿素溶液，最優(yōu)選為8m尿素溶液，其用量為：發(fā)酵液體積∶8m尿素體積＝0.2～100∶1，優(yōu)選為2～15∶1。

30、進一步的，在步驟b中，所述的分離純化的方法包括超濾微濾膜技術(shù)純化方法、柱色譜純化方法、鹽析方法、透析方法。

31、進一步的，步驟b中，分離純化方法如下：

32、(1)所述透析方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液用透析的方法純化，得到目標蛋白cf1溶液。

33、透析袋截留分子量可以為0.5-10kd，優(yōu)選的透析袋截留分子量為3.5-10kd，最優(yōu)選的透析袋截留分子量為10kd。

34、(2)所述超濾微濾方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液用超濾膜或微濾膜等膜技術(shù)純化，得到目標蛋白cf1濃縮溶液。

35、(3)所述柱色譜方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液通過柱色譜，例如各種交換柱或排阻柱色譜，分離純化得到目標蛋白cf1。

36、優(yōu)選的排阻柱是葡聚糖凝膠柱，superdex?30increase，superdex?75increase，superdex?200increase，superose?6increase等；優(yōu)選的交換柱是離子交換樹脂柱：陰離子交換樹脂柱，hitrap?q?ff，hitrap?capto?q?impres，capto?q?impres，hitrap?capto?q，hitrap?deae，toyopearl?q-650m，toyopearl?superq-650m等；陽離子交換樹脂柱，hitrapsp?ff，hitrap?capto?sp?impres，capto?sp?impres，hitrap?capto?sp，toyopearl?sp-650m，toyopearl?super?sp-650m。

37、洗脫劑可以使用本領(lǐng)域常用的洗脫劑，例如水、鹽溶液，所述鹽溶液包括氯化鈉溶液、磷酸二氫鈉溶液、磷酸氫二鈉溶液、醋酸鈉、醋酸等。

38、(4)所述鹽析方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液中用鹽析的方法純化，得到目標蛋白cf1混懸液。

39、鹽析劑可以為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鋁，硝酸銨、氯化銨、硫酸鎂等。優(yōu)選的鹽析劑為硫酸銨及其水溶液。加入飽和硫酸銨水溶液使硫酸銨終濃度達到10～50％，優(yōu)選為20～30％，更優(yōu)選為25％。

40、鹽析次數(shù)為1～3次，優(yōu)選為2次。

41、鹽析后沉淀加入純水清洗，清洗次數(shù)為2～5次，優(yōu)選為3次。

42、進一步的，步驟b純化得到的目標蛋白cf1溶液可經(jīng)冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可將濃縮液直接噴霧干燥成干粉。

43、本發(fā)明技術(shù)方案的第六方面是提供了一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有第一方面所述的角蛋白cf1或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表達載體或第四方面所述的宿主細胞以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

44、本發(fā)明上述步驟中得到的角蛋白可經(jīng)冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可把濃縮液體直接噴霧干燥成干粉，然后制成各種劑型。

45、本發(fā)明涉及一種藥物組合物，包括上述步驟中得到的任意一種角蛋白及藥學(xué)上可接受的載體。

46、本發(fā)明還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明角蛋白以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明角蛋白占藥物組合物總重量的0.1～100.0％。

47、本發(fā)明還提供一種藥物組合物，它包括藥物有效劑量的作為活性成分的蛋白質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體。

48、本發(fā)明所述的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明蛋白質(zhì)與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?/p>

49、本發(fā)明角蛋白或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺、皮膚、陰道、腹膜、直腸等，優(yōu)選口服給藥。

50、本發(fā)明角蛋白或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、腹腔注射和穴位注射等。

51、給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括水包油型、油包水型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等。固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。

52、本發(fā)明角蛋白可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。

53、為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯毗咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯毗咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與構(gòu)椽酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。

54、還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。

55、為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃菩膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。

56、為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。

57、為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明角蛋白與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明角蛋白制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。

58、例如，將本發(fā)明角蛋白制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、l,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。

59、此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。

60、為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的角蛋白或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。

61、本發(fā)明角蛋白藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明角蛋白組合物中最后的制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當?shù)恼{(diào)整，以達到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明角蛋白的每天的合適劑量范圍：本發(fā)明的角蛋白的用量為0.01～500mg/kg體重，優(yōu)選為0.5～100mg/kg體重，更優(yōu)選為1～50mg/kg體重，最優(yōu)選為2～30mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥，這取決于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或藥物組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。

62、本發(fā)明技術(shù)方案的第七方面是提供了第一方面所述的角蛋白cf1或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表達載體或第四方面所述的宿主細胞或第六方面所述的藥物組合物在制備解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗驚厥、抗癲癇、降血壓、抗炎、抗病毒藥物中的應(yīng)用。

63、為了完成本發(fā)明之目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案，具體地講，制備本發(fā)明角蛋白cf1，包括如下步驟：

64、(1)合成核苷酸序列，并測定序列的準確性；

65、優(yōu)選的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

66、(2)將核苷酸序列轉(zhuǎn)入表達載體中；

67、表達載體可以為pet系列、puc系列、pqe系列、pbv系列、pmal系列，ppic9、ppic9k、phil-s1、ppiczα/a、pyam75p，phil-d2、pa0815、ppic3k、ppicz、phwo10、pgapz、pgapza、ppic3.5k等；優(yōu)選的表達載體為pet系列載體；最優(yōu)選的表達載體為pet-28a(+)。

68、(3)將表達載體轉(zhuǎn)染入宿主細胞中；

69、宿主細胞可以為大腸桿菌或酵母；優(yōu)選的宿主細胞為大腸桿菌；

70、感受態(tài)細胞可以為bl21系列，transetta系列，rosetta系列，dh5α系列，jm系列，top系列，orgami系列，trans1-t1，tg1，tb1；y11430，mg1003，gs115(aox1)，km71，smd1168等；優(yōu)選的表達感受態(tài)細胞為bl21(de3)，transetta(de3)。

71、(4)將在適當?shù)臈l件下，發(fā)酵培養(yǎng)宿主細胞，誘導(dǎo)表達目標蛋白cf1；

72、發(fā)酵設(shè)備可以采用搖瓶或發(fā)酵罐；

73、培養(yǎng)基可以為lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基、sb培養(yǎng)基、sob培養(yǎng)基、soc培養(yǎng)基，pda培養(yǎng)基、ypd培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、doba培養(yǎng)基、米曲培養(yǎng)基及其改良配方等；搖瓶發(fā)酵優(yōu)選lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基，最優(yōu)選為tb培養(yǎng)基；發(fā)酵罐優(yōu)選lb培養(yǎng)基及其改良配方。

74、誘導(dǎo)劑可以為iptg、乳糖、阿拉伯糖等；優(yōu)選為iptg、乳糖。

75、(5)目標蛋白cf1產(chǎn)物富集；

76、步驟(4)獲得的發(fā)酵菌液，離心，棄去上清液；沉淀懸浮于緩沖液中，破碎菌體，再離心，棄去上清液；沉淀用清洗劑清洗后，再用尿素溶液溶解，得到cf1粗蛋白溶液。

77、其中，緩沖液優(yōu)選為buffer?a，其用量為：發(fā)酵液體積∶buffer?a體積＝1～100∶1，優(yōu)選為5～10∶1；

78、清洗劑可以為尿素溶液、鹽酸胍溶液、triton、buffer?a等，優(yōu)選為尿素溶液，最優(yōu)選為2m尿素溶液(可含有1％triton)，其用量為：發(fā)酵液體積：尿素溶液體積＝0.2～100∶1，優(yōu)選為1～15∶1；清洗次數(shù)為3～10次，優(yōu)選為6次；

79、尿素溶液優(yōu)選為4m～8m尿素溶液，最優(yōu)選為8m尿素溶液，其用量為：發(fā)酵液體積：8m尿素溶液體積＝0.2～100：1，優(yōu)選為2～15：1。

80、(6)分離純化目標蛋白cf1：

81、步驟(5)獲得的粗蛋白溶液，需經(jīng)過純化獲得目標蛋白cf1。所述純化可以通過透析、或超濾微濾、或柱色譜、或鹽析步驟進行。

82、a.所述透析步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液用透析的方法純化，得到目標蛋白cf1溶液。

83、透析袋截留分子量可以為0.5-10kd，優(yōu)選的透析袋截留分子量為3.5-10kd，最優(yōu)選的透析袋截留分子量為10kd。

84、b.所述超濾微濾步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液用超濾膜或微濾膜等膜技術(shù)純化，得到目標蛋白cf1濃縮溶液。

85、c.所述柱色譜步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液通過柱色譜，例如各種交換柱或排阻柱色譜，分離純化得到目標蛋白cf1。

86、優(yōu)選的排阻柱是葡聚糖凝膠柱，superdex?30increase，superdex?75increase，superdex?200increase，superose?6increase等；優(yōu)選的交換柱是離子交換樹脂柱：陰離子交換樹脂柱，hitrap?q?ff，hitrap?capto?q?impres，capto?q?impres，hitrap?capto?q，hitrap?deae，toyopearl?q-650m，toyopearl?superq-650m等；陽離子交換樹脂柱，hitrapsp?ff，hitrap?capto?sp?impres，capto?sp?impres，hitrap?capto?sp，toyopearl?sp-650m，toyopearl?super?sp-650m。最優(yōu)選的是陰離子交換樹脂柱。

87、洗脫劑可以使用本領(lǐng)域常用的洗脫劑，例如水、鹽溶液，所述鹽溶液包括氯化鈉溶液、磷酸二氫鈉溶液、磷酸氫二鈉溶液、醋酸鈉、醋酸等。

88、d.所述鹽析步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液中用鹽析的方法純化，得到目標蛋白cf1混懸液。

89、鹽析劑可以為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鋁，硝酸銨、氯化銨、硫酸鎂等。優(yōu)選的鹽析劑為硫酸銨及其水溶液。加入飽和硫酸銨水溶液使硫酸銨終濃度達到10～50％，優(yōu)選為20～30％，更優(yōu)選為25％。

90、鹽析次數(shù)為1～3次，優(yōu)選為2次。

91、鹽析后沉淀加入純水清洗，清洗次數(shù)為2～5次，優(yōu)選為3次。

92、步驟a～d純化得到的目標蛋白cf1溶液可經(jīng)冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可將濃縮液直接噴霧干燥成干粉。

93、本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

94、1、本發(fā)明蛋白為首次獲得的角蛋白，本發(fā)明的制備方法具備收率高、樣品純度高的特點。

95、2、本發(fā)明通過蛋白cf1對酵母誘導(dǎo)的sd大鼠發(fā)熱模型的藥效試驗研究，證明蛋白cf1在造模后8小時具有顯著的降低模型動物體溫升高的作用；通過蛋白cf1對脂多糖(lps)誘導(dǎo)的sd大鼠發(fā)熱模型的藥效試驗研究，證明蛋白cf1在造模后2小時具有顯著的降低模型大鼠體溫的作用；

96、3、本發(fā)明通過蛋白cf1對小鼠氨水引咳法鎮(zhèn)咳的藥效試驗研究，證明蛋白cf1能夠減少咳嗽次數(shù)，具有鎮(zhèn)咳作用；