本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術和數(shù)字醫(yī)學領域，具體涉及一種液相dna?fish(液相下核酸原位雜交)分析方法，用于防止液相dna?fish分析時細胞破裂。

背景技術：

1、dna?fish分析常用于科研和臨床，是對分離出的靶細胞進行細胞學和分子生物學特征分析的有效手段，常規(guī)的dna?fish多是將靶細胞離心到載玻片上，干燥、染色、分析后，如果再要對單細胞進行進一步的測序或全基因組分析，就會遇到難以獲得完整的單個細胞，其單細胞全基因組分析也就不能完美進行。所以，如何最大程度保持細胞的生物形態(tài)完好是dna?fish分析后獲得完整單細胞的關鍵性步驟。目前市面上常用的用于dna?fish保持細胞完好性的試劑主要是甲醇-冰醋酸溶液，由于醇類一般會使細胞發(fā)生皺縮變形，會對后續(xù)細胞研究產(chǎn)生影響，而冰醋酸由于其腐蝕性、揮發(fā)性以及刺鼻氣味常常污染實驗環(huán)境，引起操作員的眼部和鼻咽部嚴重不適，因此并不適合長期使用，而且甲醇-冰醋酸溶液由于極易揮發(fā)不易保存，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，操作麻煩，同樣由于極易揮發(fā)為保證細胞固定到位需要將細胞浸泡其中，常常用量較多，增加了試驗后處理廢棄有機溶劑的難度。

技術實現(xiàn)思路

1、針對液相dna?fish分析時對細胞完整性的需求，本發(fā)明主要目的在于提供了一種液相dna?fish分析方法，可以保證靶細胞在dna高溫變性以及染色操作過程中不發(fā)生破裂，有利于對細胞同時做細胞層面和原位基因雜交的分析，而且分析過后的細胞由于形態(tài)結構完好，還可用于單細胞的提取及全基因組學的測序等進一步的分析。

2、為了實現(xiàn)上述目的，在基礎的實施方案中，本發(fā)明提供一種液相下、防止細胞破裂的dna?fish分析方法，包括如下步驟：

3、s1、將細胞培養(yǎng)皿中待做液相dna?fish分析的靶細胞用細胞固定液固定10～15min。

4、所述固定液是指濃度為1％～100％的甲醛溶液，固定液用量為50-500ul。

5、s2、使用上述固定過的靶細胞進行蛋白水平的靶細胞免疫熒光的染色鑒定。

6、s3、加入2×ssc緩沖液，室溫浸泡10～15min。

7、s4、吸棄2×ssc緩沖液，用70％～100％梯度濃度的乙醇依次浸泡1～2min脫水，將細胞內(nèi)的水分置換出來，便于探針試劑浸入標本中。

8、采用梯度濃度的乙醇脫水更溫和，直接用高濃度酒精會使細胞急劇脫水收縮及變硬變脆，不利于維持細胞結構完整。

9、s5、吸棄乙醇液，用2×ssc緩沖液漂洗一遍，立即加入原位雜交探針試劑，注意避光，并在孔板間隙中加入純水保持孔板內(nèi)濕度，防止試劑揮發(fā)。

10、s6、將細胞培養(yǎng)板裝入自封袋，浸沒入82～83℃水浴中孵育10～12min，再轉移至50～52℃水浴中浸沒孵育1.5～2h。

11、s7、用2×ssc緩沖液洗滌一遍，向所述細胞培養(yǎng)板中加入dapi染色液復染，靜置3～5min，加入2×ssc緩沖液。

12、s8、立即將細胞培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下成像觀察取圖。

13、可選地，所述待做dna?fish液相分析的靶細胞包括培養(yǎng)的細胞系細胞如mcf-7、mba-md-231乳腺癌細胞、hepg2肝癌細胞、a549肺癌細胞等，富集分離得到的循環(huán)腫瘤細胞(ctc)或組織來源的單細胞。

14、可選地，所述靶細胞蛋白質水平的免疫熒光染色鑒定可使用分析試劑盒產(chǎn)品，用于對細胞膜蛋白進行標志物標記和染色。

15、本發(fā)明步驟s3所述的2×ssc緩沖液優(yōu)于純水或ddh2o，可使細胞穩(wěn)定在液相狀態(tài)而不發(fā)生破裂。

16、通過上述技術方案，本發(fā)明在對靶細胞進行液相dna?fish分析時，可以完全避免細胞在高溫變性以及染色過程中發(fā)生破裂而損失研究對象，尤其是當病人樣本中僅有幾個甚至一個靶細胞的情況時，對細胞的精準分析顯得尤為重要。本發(fā)明通過對分離出的靶細胞加入微量4％甲醛溶液進行短時處理即可達到細胞固定的目的，操作簡便，且細胞在后續(xù)高溫變性過程中完全不發(fā)生破裂，細胞形態(tài)完好率高，在染色操作過程中用2×ssc緩沖液替代ddh2o用于保持細胞在液相狀態(tài)，有效減少了細胞破裂，在臨床和科研上實用性強。

17、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：

18、本發(fā)明的方法用微量4％甲醛溶液對靶細胞進行短時固定，使標本中蛋白質等物質快速變性，在后期處理中，不會改變形態(tài)及性質，防止dna?fish液相分析時細胞破裂，充分保證了細胞在dna高溫變性過程中的形態(tài)完好性，而且操作簡便，不會造成環(huán)境污染，也不會產(chǎn)生大量有機廢液，此外為了保證細胞一直處于液相條件保持原有立體形態(tài)，在梯度乙醇處理后，為避免乙醇快速揮發(fā)致使細胞干癟粘貼到底板上，需要立即加入2×ssc緩沖液恢復細胞液相環(huán)境，ssc緩沖液中的鹽離子(na)中和rna/dna主鏈上的負電荷，可提高探針和靶序列的結合效率，常用于雜交過程達到變性和清洗目的，因此選澤2×ssc緩沖液用于細胞保存較為合適。經(jīng)過固定和液相染色鑒定的細胞，充分保持了細胞原有立體形態(tài)并處于懸浮狀態(tài)，利于對細胞同時做細胞層面和基因層面的精準分析，而且分析過后的細胞由于形態(tài)結構完好，還可用于單細胞的提取及基因測序分析。

技術特征：

1.一種液相dna?fish分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟s1中，所述待做液相dna?fish分析的靶細胞包括培養(yǎng)的細胞系細胞、富集分離得到的循環(huán)腫瘤細胞(ctc)或組織來源的單細胞。

3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的細胞系細胞包括mcf-7、mba-md-231乳腺癌細胞、hepg2肝癌細胞、a549肺癌細胞。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟s2中，所述靶細胞蛋白質水平的免疫熒光染色鑒定使用分析試劑盒產(chǎn)品，用于對細胞膜蛋白進行標志物標記和染色。

技術總結
本發(fā)明公開了一種液相DNA原位雜交(DNA?FISH)分析方法，包括：將待做液相DNA?FISH分析的靶細胞，用特定固定液對靶細胞進行固定，并在染色操作過程中使用特定試劑緩沖液進行濕潤或洗滌操作，能順利完成靶細胞免疫染色分析以及后續(xù)的DNA原位雜交熒光分析，整個過程可在細胞培養(yǎng)皿中完成，不需要干燥步驟，處理過程中，靶細胞不會破裂。本發(fā)明能在液相下完成DNA?FISH分析同時保持靶細胞的形態(tài)完好性，極有利于對細胞同時做多組學分析，更有利于分析過后進行完整單細胞的提取和進一步的全基因組學分析。

技術研發(fā)人員：鄧亞光,李宴清,李春妍
受保護的技術使用者：宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/9