本發(fā)明涉及生物，具體涉及化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶及其制備工藝和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶需要保證該酶在化學(xué)修飾后、熱激活前(尤其是50℃條件下)活性完全封閉，但是高溫預(yù)變性階段(95℃條件下)能恢復(fù)活性。目前常用的化學(xué)修飾方法為酸酐修飾法，但是不同酸酐修飾所得的熱啟動(dòng)酶性能穩(wěn)定性等又有較大差異。

2、酸酐修飾的原理主要是利用酸酐對(duì)蛋白分子中特定的活性氨基酸基團(tuán)(主要是位于蛋白表面暴露于溶劑中的賴氨酸末端氨基)進(jìn)行可逆地結(jié)合(酰化反應(yīng))，在常溫或較低溫度下封閉其活性，當(dāng)溫度升高時(shí)這種化學(xué)修飾結(jié)合脫落，從而達(dá)到熱啟動(dòng)的目的。

3、酸酐可逆修飾的主要原理為在堿性條件下(tris-hcl緩沖液，ph＞8)酸酐與賴氨酸殘基中末端氨基形成酰胺鍵，利用tris-hcl緩沖液ph隨溫度變化較大(△pka/℃＝-0.031)的特點(diǎn)，在高溫環(huán)境中，隨著tris緩沖液ph降低到6.0以下(kadlík?et?al.,2003)，此時(shí)酸酐和賴氨酸之間的相互作用開(kāi)始發(fā)生解離，蛋白恢復(fù)到未修飾狀態(tài)發(fā)揮功能活性，從而達(dá)到熱啟動(dòng)的目的。

4、利用化學(xué)修飾制備熱啟動(dòng)taq酶需要同時(shí)滿足修飾后復(fù)合物穩(wěn)定、活性封閉但激活后活性釋放的需求，選擇的酸酐不能是不可逆修飾，同時(shí)穩(wěn)定性又不能太差。前者容易造成修飾后復(fù)合物的活性無(wú)法恢復(fù)；而后者修飾后的復(fù)合物不穩(wěn)定，不利于產(chǎn)品的長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，且在熱激活溫度之前就能釋放活性、造成非特異性擴(kuò)增。

5、酸酐除了和氨基酸中氨基(如賴氨酸氨基)發(fā)生?；磻?yīng)之外，還會(huì)有一些副反應(yīng)，即一少部分酸酐和蛋白中存在的羥基和巰基也會(huì)發(fā)生?；磻?yīng)。其中，酸酐和酪氨酸、半胱氨酸、組氨酸殘基的?；a(chǎn)物很不穩(wěn)定，生成后就很快分解，氨基酸恢復(fù)原狀。但是部分酸酐和蛋白分子中絲氨酸或蘇氨酸殘基形成的產(chǎn)物較為穩(wěn)定并且不容易分離。這些副反應(yīng)很可能會(huì)影響化學(xué)修飾酶熱激活后活性的恢復(fù)(palacián?et?al.,1990)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白修飾過(guò)程中酸酐濃度越高，蛋白中氨基基團(tuán)和羥基基團(tuán)被修飾的程度越深，羥基基團(tuán)被修飾可以看作是蛋白酸酐化學(xué)修飾過(guò)程中的副反應(yīng)。因此從氨基酸酐修飾和活性恢復(fù)的角度，需進(jìn)一步探索出適合熱啟動(dòng)taq酶制備的酸酐。同時(shí)化學(xué)修飾taq?dna聚合酶熱激時(shí)間依然較長(zhǎng)，需要在95℃熱激至少10min，對(duì)于pcr反應(yīng)95℃預(yù)處理時(shí)間小于10min的情況不適用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶及其制備工藝和應(yīng)用，本發(fā)明提供了的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶制備工藝簡(jiǎn)單，獲得的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性好，在激活前封閉活性封閉徹底且穩(wěn)定，激活后也能夠更好的恢復(fù)活力。

2、本發(fā)明提供了所述的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶的制備方法，包括取檸康酸酐和taq?dna聚合酶混合后，獲得所述化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶。

3、在一些實(shí)施例中，所述檸康酸酐和所述taq?dna聚合酶摩爾比為(10～200)：1。

4、在一些具體實(shí)施例中，所述檸康酸酐與所述taq?dna聚合酶摩爾比為50:1。

5、進(jìn)一步的，所述混合包括在預(yù)冷條件下將所述檸康酸酐溶液和所述taq?dna聚合酶混勻后獲得混合物，所述混合物于37℃攪拌反應(yīng)10～120min。

6、在一些具體實(shí)施例中，所述攪拌反應(yīng)的時(shí)間為30min。

7、進(jìn)一步的，所述攪拌反應(yīng)后，在所述混合物中加入緩沖液混勻后透析，獲得所述化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶。

8、在一些實(shí)施例中，所述緩沖液包括硼酸緩沖液或nahco3/na2co3，所述緩沖液的ph為8.6～10.0，所述緩沖液與所述混合物的體積比為1:2。

9、在一些具體實(shí)施例中，所述緩沖液為ph?9.1的nahco3/na2co3緩沖液。

10、進(jìn)一步的，還包括將所述透析后的溶液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，獲得的所述化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶。

11、本發(fā)明提供了化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶的激活方法，包括取所述化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶進(jìn)行熱激活。

12、優(yōu)選的，所述熱激活包括95℃激活5～10min，所述熱激活的緩沖液包括：10mmtris-hcl，2mm?kcl，3.5mm?mgcl2，16mm(nh4)2so4和0.1vol％tween20。

13、在一些具體實(shí)施例中，所述熱激活的時(shí)間為10min。

14、本發(fā)明提供了化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶的儲(chǔ)存方法，包括取所述化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶封閉保存。

15、優(yōu)選的，所述封閉保存的緩沖液包括：20mm?tris緩沖液，100mm?kcl，0.1mmedta·2na，1mm?dtt，50vol％glycerol和2.5vol％peg8000。

16、本發(fā)明還提供了如下ⅰ～ⅳ所示中至少一項(xiàng)在擴(kuò)增核酸中的應(yīng)用：

17、ⅰ、所述的制備方法制得的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶；

18、ⅱ、所述的激活方法激活的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶；

19、ⅲ、所述的儲(chǔ)存方法儲(chǔ)存的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶。

20、進(jìn)一步的，所述核酸包括新型冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體、副流感i型、副流感ii型、副流感iii型、腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒、人博卡病毒、百日咳桿菌、腸道病毒、嗜肺軍團(tuán)菌或冠狀病毒的基因組核酸中的一種或多種。

21、本發(fā)明還提供了核酸擴(kuò)增試劑盒，包括如下①～④中至少一項(xiàng)：

22、②、所述的制備方法制得的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶；

23、②、所述的激活方法激活的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶；

24、③、所述的儲(chǔ)存方法儲(chǔ)存的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶。

25、進(jìn)一步的，所述核酸擴(kuò)增試劑盒包括體外診斷rt-qpcr試劑盒、新型冠狀肺炎診斷試劑盒、流感病毒檢測(cè)試劑盒、合胞病毒檢測(cè)試劑盒、肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒、肺炎支原體檢測(cè)試劑盒、副流感i型檢測(cè)試劑盒、副流感ii型檢測(cè)試劑盒、副流感iii型檢測(cè)試劑盒、腺病毒檢測(cè)試劑盒、鼻病毒檢測(cè)試劑盒、偏肺病毒檢測(cè)試劑盒、人博卡病毒檢測(cè)試劑盒、百日咳桿菌檢測(cè)試劑盒、腸道病毒檢測(cè)試劑盒、嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒或冠狀病毒檢測(cè)試劑盒中的一種或多種。

26、本發(fā)明提供了化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶的制備方法，包括取檸康酸酐和taqdna聚合酶混合后，獲得所述化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶。本發(fā)明還提供了化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶的激活方法、儲(chǔ)存方法及其應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)dna聚合酶，以較低成本制備熱啟動(dòng)性能良好，工藝流程簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，批間差異小，穩(wěn)定性好，熱啟動(dòng)效果好，能夠?qū)崿F(xiàn)克級(jí)別的制備。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明制備的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq?dna聚合酶熱啟動(dòng)性能更嚴(yán)謹(jǐn)，在50℃未檢測(cè)到活性，熱激活前絕大部分活性被封閉，熱激活后活性恢復(fù)好，儲(chǔ)存穩(wěn)定性好，-20℃儲(chǔ)藏1年之內(nèi)酸酐不會(huì)發(fā)生脫落，仍能保持活性封閉，制備工藝穩(wěn)定，批間差異更小，能夠?qū)崿F(xiàn)性能穩(wěn)定的化學(xué)修飾熱啟動(dòng)taq酶生產(chǎn)制備，適宜推廣應(yīng)用。