發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及基因編輯和基因治療領(lǐng)域，特別是靶向基因插入。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、病理性基因缺陷可以是幾個堿基到大的缺失。哺乳動物基因組中基因大小的片段的靶向dna整合可以實現(xiàn)治療信息和新功能的精確添加。已經(jīng)開發(fā)出基于非同源末端連接(nhej)的精確基因遞送方法，例如不依賴于同源性的靶向整合(hiti)。這種方法已被證明可以插入幾千個堿基，但對于非常大的編輯仍然效率低下。雖然hiti可能可以遞送外顯子，但它的效率可能不足以穩(wěn)健遞送基因例如dmd(～14kb)或abca4(～6.8kb)的cdna。最近，已通過融合dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域擴展了hiti以提高dna效率。在細菌中，已經(jīng)證明了使用crispr可編程轉(zhuǎn)座子進行精確基因遞送，但該技術(shù)尚未用于哺乳動物細胞。

2、基因組編輯新方法的開發(fā)使得人類基因治療(hgt)應(yīng)用得以擴展。許多hgt策略都基于dna載荷的加入，該載荷可以彌補基因缺陷和/或為受體細胞提供合成特性。傳統(tǒng)上，治療性載荷的遞送基于病毒和非病毒載體，這些載體會不受控制地整合到基因組中。雖然精確的遞送技術(shù)正在出現(xiàn)，但病毒載體介導(dǎo)的不受控制的遞送已使大量患者受益。已經(jīng)觀察到插入性突變事件，這些事件導(dǎo)致基因治療試驗的首次嘗試在白血病病例與基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的scid-x1基因治療相關(guān)聯(lián)后被叫停。最近在car-t治療中再次觀察到載體驅(qū)動的克隆擴增，并且在與基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物strimvelis相關(guān)聯(lián)的白血病病例中也觀察到了這種現(xiàn)象。raav可引起插入性突變并誘導(dǎo)克隆擴增。piggybac轉(zhuǎn)座酶(pb)等無病毒技術(shù)與致癌誘導(dǎo)有關(guān)。慢病毒載體在治療上用于不受控制地插入轉(zhuǎn)基因，用于離體應(yīng)用和體內(nèi)應(yīng)用。我們觀察到通過突變整合酶蛋白并在慢病毒顆粒中整合spcas9核酸酶，慢病毒載體可以被重編程以精確整合轉(zhuǎn)基因dna。

3、使用zfn、talen和crispr?cas9等工具發(fā)現(xiàn)和實施精確的遞送策略，有可能避免不希望的基因破壞或激活，并能同時進行基因的失活和進入，這對于治療性基因組調(diào)節(jié)是關(guān)鍵特征。此類技術(shù)也引發(fā)了與安全相關(guān)的擔憂。據(jù)報道，載荷的整合可能不精確，產(chǎn)生不同的意外整合結(jié)果，例如供體在脫靶的切割位點處整合以及諸如倒位或易位的基因組重排。

4、因此，對精確且安全的基因遞送策略，特別是非常大的序列的遞送，存在尚未滿足的需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及一種組合物，其包含：

2、(i)編碼具有整合活性受損的慢病毒載體的核酸，可選地包含適體結(jié)合蛋白，

3、(ii)編碼包含rna引導(dǎo)的核酸酶或切口酶的多肽或蛋白的核酸，

4、(iii)編碼與適體融合的引導(dǎo)rna(grna)的核酸，

5、(iv)編碼目標轉(zhuǎn)基因的核酸，以及

6、(v)可選地，編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含：

7、-第一蛋白，包含gag多聚蛋白或由gag多聚蛋白組成，

8、-第二蛋白，包含適體結(jié)合蛋白或由適體結(jié)合蛋白組成，以及

9、-可選地，第三蛋白，包含pol多聚蛋白或由pol多聚蛋白組成。

10、在一些實施方案中，適體結(jié)合蛋白是ms2噬菌體衣殼蛋白(mcp)，優(yōu)選與seq?idno:61具有至少75％同一性；并且適體是ms2?rna四環(huán)結(jié)合序列，優(yōu)選與seq?id?no:63具有至少75％同一性。

11、在一些實施方案中，rna引導(dǎo)的核酸酶或切口酶不與整合酶融合。

12、在一些實施方案中，rna引導(dǎo)的核酸酶或切口酶是cas蛋白。

13、在一些實施方案中，rna引導(dǎo)的核酸酶或切口酶與突變的高活性piggybac轉(zhuǎn)座酶結(jié)合。

14、在一些實施方案中，(i)的整合酶和/或(v)的pol多聚蛋白中包含的整合酶當存在時包含選自以下的位置處的至少一個氨基酸突變：seq?id?no:1的hiv-1整合酶的10、11、13、64、94、116、117、119、120、122、124、128、152、164、168、170、185、186、231、264、266，或在另一整合酶中的相應(yīng)位置處。

15、在一些實施方案中，(i)和/或(v)的整合酶包含至少一個選自以下的氨基酸突變：seq?id?no:1的hiv-1整合酶的d10k、e11k、e13k、d64a、d64e、g94d、g94e、g94r、g94k、d116a、d116e、n117d、n117e、n117r、n117k、s119a、s119p、s119t、s119g、s119d、s119e、s119r、s119k、n120d、n120e、n120r、n120k、t122k、t122i、t122v、t122a、t122r、a124d、a124e、a124r、a124k、a128t、e152a、e152d、d164n、q168l、q168a、e170g、f185k、k186e、r231g、r231k、r231d、r231e、r231s、k264r、k266r和k273r，或另一整合酶中的相應(yīng)位置處。

16、在一些實施方案中，(i)的慢病毒載體的整合活性通過整合酶序列中的至少一個突變而降低或消除，所述突變選自：d116n取代、d164n取代、插入早熟終止密碼子以及整合酶基因的缺失(δin)，編號基于seq?id?no:1的hiv-1整合酶。

17、本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)慢病毒顆粒的方法，包括以下步驟：

18、(i)用本發(fā)明的組合物轉(zhuǎn)染在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)的慢病毒生產(chǎn)細胞，以及

19、(ii)收集所述慢病毒生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)基中的慢病毒顆粒。

20、本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明的生產(chǎn)慢病毒顆粒的方法獲得的慢病毒顆粒群。

21、本發(fā)明還涉及慢病毒顆粒群，其包含慢病毒顆粒，所述慢病毒顆粒包含以下或由以下組成：

22、a.慢病毒蛋白和/或基因或其部分，其中慢病毒整合酶具有受損的整合活性，

23、b.rna引導(dǎo)的核酸酶或切口酶，優(yōu)選cas9蛋白，或編碼其的核酸序列，

24、c.引導(dǎo)rna，其與適體融合，優(yōu)選與至少一個ms2?rna四環(huán)結(jié)合序列融合，以及

25、d.可選地，融合蛋白，包含(1)第一蛋白，其包含gag多聚蛋白或由gag多聚蛋白組成，(2)第二蛋白，其包含適體結(jié)合蛋白或由適體結(jié)合蛋白組成，以及可選地(3)第三蛋白，其包含pol多聚蛋白或由pol多聚蛋白組成，或編碼其的核酸序列。

26、本發(fā)明還涉及一種將目標轉(zhuǎn)基因位點特異性整合到細胞的基因組中的體外方法，所述方法包括用本發(fā)明的慢病毒顆粒群感染所述細胞，其中慢病毒顆粒群包含目標轉(zhuǎn)基因，或其中目標轉(zhuǎn)基因在慢病毒顆粒群之前、同時或之后遞送到細胞。

27、本發(fā)明還涉及本發(fā)明的慢病毒顆粒群，用作藥物。

28、本發(fā)明還涉及本發(fā)明的慢病毒顆粒群，用于將目標轉(zhuǎn)基因位點特異性整合到細胞的基因組中，其中慢病毒顆粒群包含目標轉(zhuǎn)基因，或其中目標轉(zhuǎn)基因?qū)⒃诼《绢w粒群之前、同時或之后遞送到細胞。

29、本發(fā)明還涉及本發(fā)明的慢病毒顆粒群，用于治療有需要的受試者的疾病，優(yōu)選基因疾病，其中慢病毒顆粒群包含目標轉(zhuǎn)基因，或其中目標轉(zhuǎn)基因?qū)⒃诼《绢w粒群之前、同時或之后遞送至細胞。

30、定義

31、在本公開中，任何使用單數(shù)形式“a”、“an”或“the”均包括單數(shù)指代，也包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確說明。因此，例如，對“藥劑”的指代包括單個藥劑和多個這樣的藥劑。

32、“核酸(序列)”和“核苷酸序列”可互換使用用于指由單體核苷酸組成或包含單體核苷酸的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸；它可以是dna、rna或兩者的混合。它可以是化學修飾的或人工的；例如，它包括肽核酸(pna)、嗎啉代(morpholinos)和鎖核酸(lna)，以及乙二醇核酸(gna)和蘇糖核酸(tna)。這些核酸都是通過分子骨架的變化而區(qū)別于天然存在的dna或rna。此外，可以使用硫代磷酸核苷酸。其他脫氧核苷酸類似物包括但不限于甲基膦酸酯、磷酰胺、二硫代磷酸酯、n3'p5'磷酰胺和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2'o-烯丙基類似物和2'o-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯，其可用于本公開的核酸中。

33、“多肽”、“肽”、“蛋白”和“氨基酸序列”可互換使用用于指氨基酸殘基的聚合物。除非另有說明，氨基酸殘基的聚合物可以是任意長度。該術(shù)語還適用于其中一個或多個氨基酸是相應(yīng)天然存在的氨基酸的化學類似物或修飾衍生物的氨基酸聚合物。

34、“核酸酶”是指催化核酸序列內(nèi)核酸水解的酶。核酸酶活性可導(dǎo)致單鏈或雙鏈核酸分子的斷裂，其中核酸分子可以是dna或rna。

35、“cas9”或“cas9核酸酶”指rna引導(dǎo)的核酸酶，包含cas9蛋白或其片段(例如，包含cas9的活性或非活性dna切割結(jié)構(gòu)域和/或cas9的grna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白)。cas9核酸酶有時也稱為casn1核酸酶或crispr(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列)結(jié)合核酸酶。crispr是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可產(chǎn)生對抗移動遺傳元件(病毒、轉(zhuǎn)座元件和接合質(zhì)粒)的保護作用。crispr簇包含間隔區(qū)(與先前的移動元件互補的序列)，并且靶向入侵的核酸。crispr簇被轉(zhuǎn)錄并加工成crispr?rna(crrna)。在ii型crispr系統(tǒng)中，pre-crrna的正確加工需要反式編碼小rna(tracrrna)、內(nèi)源性核糖核酸酶3(rnc)和cas9蛋白。tracrrna可作為核糖核酸酶3輔助的pre-crrna加工的向?qū)?。隨后，cas9/crrna/tracrrna復(fù)合物通過內(nèi)切核酸酶切割與間隔區(qū)互補的線性或環(huán)狀dsdna靶標。不與crrna互補的靶標鏈首先通過內(nèi)切核酸酶被切割，然后通過外切核酸酶進行3'-5'修剪。在自然界中，dna結(jié)合和切割通常需要蛋白和兩種rna。然而，可以對單引導(dǎo)rna(“sgrna”或簡稱為“grna”)進行工程化，以將crrna和tracrrna兩者的各個方面整合到單rna分子中。

36、cas9識別crispr重復(fù)序列中的短基序(pam或原型間隔區(qū)相鄰基序)，以幫助區(qū)分自我和非我。cas9核酸酶序列和結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。cas9直系同源物已在各種物種中有描述，包括但不限于釀膿鏈球菌(s.pyogenes)和嗜熱鏈球菌(s.thermophilus)?；诒竟_，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚其他合適的cas9核酸酶和序列，并且此類cas9核酸酶和序列包括來自chylinski等，2013(rna?biol.10(5):726-37)(其全部內(nèi)容通過引用并入本文)中公開的生物體和基因座的cas9序列。

37、在一些實施方案中，cas9核酸酶具有無活性的(例如，失活的)dna切割結(jié)構(gòu)域。核酸酶失活的cas9蛋白可以互換地稱為“dcas9”蛋白(指核酸酶“死”的cas9)。本領(lǐng)域已知用于生成具有無活性dna切割結(jié)構(gòu)域的cas9蛋白(或其片段)的方法(參見，例如，jinek等,2012.science.337(6096):816-821；qi等,2013.cell.152(5):1173-83，其整體內(nèi)容通過引用并入本文)。

38、“外源”是指任何不天然存在于目標細胞或生物體中，但可以通過一種或多種基因、生物化學或其他方法引入其中的分子。分子在細胞或生物體中的天然存在也可以根據(jù)其特定發(fā)育階段和環(huán)境條件來確定。因此，例如，僅在肌肉胚胎發(fā)育期間存在的分子對于成年肌肉細胞而言是外源分子。類似地，由熱休克誘導(dǎo)的分子對于未熱休克的細胞而言是外源分子。外源分子可以包括例如功能失調(diào)的內(nèi)源分子的有功能版本或正常功能的內(nèi)源分子的功能失調(diào)版本。相比之下，術(shù)語“內(nèi)源”是指在特定環(huán)境條件下在特定發(fā)育階段正常存在于細胞或生物體中的任何分子。

39、“融合蛋白”是指包含兩個或更多個融合在一起的氨基酸序列(即來自兩個或更多個不同的蛋白和/或肽)的單鏈雜合多肽。兩個或更多個氨基酸序列可以通過直接肽鍵融合在一起，也可以通過肽接頭間接融合在一起。融合蛋白可以特別地完全由單個核酸序列編碼。

40、“基因”通常指編碼蛋白的dna區(qū)域(即編碼區(qū))。該術(shù)語還可包括本身不編碼蛋白的dna區(qū)域(即非編碼區(qū))。后者包括例如轉(zhuǎn)錄成功能性非編碼rna分子(例如轉(zhuǎn)移rna、核糖體rna、調(diào)節(jié)性rna等)的區(qū)域。其他非編碼區(qū)調(diào)節(jié)編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄和翻譯(即調(diào)節(jié)元件)，或用作建構(gòu)元件(例如支架/基質(zhì)附著區(qū))、dna復(fù)制起點、著絲?；蚨肆５?。調(diào)節(jié)元件包括但不限于啟動子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列(例如核糖體結(jié)合位點[rbs]和內(nèi)部核糖體進入位點[ires])、增強子、沉默子、絕緣子、邊界元件、復(fù)制起點、基質(zhì)附著位點和基因座控制區(qū)。

41、“真核”是指細胞或由此類細胞組成的生物體，這些細胞不是細菌細胞(原核細胞)。真核細胞包括但不限于真菌細胞、植物細胞和動物細胞(例如，哺乳動物細胞和人類細胞)。

42、“轉(zhuǎn)染”及其任何詞形變化是指通過非病毒方式將一個或幾個核酸分子(dna和/或rna)引入一個或多個細胞，無論是體外還是體內(nèi)。轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和電穿孔。

43、“轉(zhuǎn)導(dǎo)”及其任何詞形變化是指利用病毒載體，例如病毒、病毒顆?；虿《据d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)及其衍生的載體，將一種或多種核酸分子(dna和/或rna)引入一個或多個細胞。

44、“切割”是指dna分子共價骨架的斷裂。切割可通過多種方法啟動，包括但不限于磷酸二酯鍵的酶促或化學水解。單鏈切割和雙鏈切割均有可能，雙鏈切割可由兩個不同的單鏈切割事件引起。dna切割可導(dǎo)致產(chǎn)生平末端或交錯末端。

45、“特異性”是指選擇性結(jié)合與選定序列具有一定序列同一性的序列的能力。

46、“插入”和“整合”是指將核酸序列加入到第二核酸序列或基因組或其部分中。插入可以是“特異的”、“位點特異性的”、“靶向的”或“中靶的(on-targeted)”：這些形容詞定義將核酸插入第二核酸的特定位點或基因組或其部分的特定位點(即，特意選擇用于插入的位點)。與之相比，形容詞“隨機的”、“非靶向的(non-targeted)”或“脫靶的(off-targeted)”是指將核酸非特異性和/或非預(yù)期地插入不希望的位點。術(shù)語“總計”或“全部”是指插入的總數(shù)。

47、“突變”是指將序列(例如核酸或氨基酸序列)內(nèi)的一個殘基用另一個殘基取代；和/或是指核酸或氨基酸序列內(nèi)一個或多個殘基的缺失或插入。突變通常在本文中通過表明原始殘基、隨后是該殘基在序列內(nèi)的位置、然后表明新取代的殘基來描述。本文提供的進行氨基酸取代(突變)的各種方法都是本領(lǐng)域公知的，并且由例如green&sambrook,2012(molecular?cloning:alaboratory?manual(4th?ed.).cold?spring?harbor?laboratorypress,cold?spring?harbor,n.y.)提供。

48、“整合酶”是指由逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如hiv)基因組產(chǎn)生的酶，可催化核酸序列在宿主細胞基因組內(nèi)的整合。與瞬時表達的核酸序列(例如轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒)相反，整合的核酸序列由細胞穩(wěn)定表達而無論有絲分裂事件如何，并與基因組的其余部分一起復(fù)制。

49、“轉(zhuǎn)座酶”是指結(jié)合到轉(zhuǎn)座子末端并通過剪切粘貼機制或復(fù)制轉(zhuǎn)座機制催化其移動到基因組另一部分的酶。

50、“突變的”，指代序列(例如氨基酸序列或核酸序列)時是指該序列與參考序列(例如野生型序列)不同。通常，與參考序列(例如相應(yīng)的野生型序列)相比，突變序列包含以下至少一種：一個或多個殘基的取代、添加或缺失。

51、“接頭”是指連接兩個相鄰分子或部分的化學基團或分子。

52、“同一性(identity)”或“同一(identical)”在用于兩個或更多個氨基酸序列或兩個或更多個核酸序列之間的序列關(guān)系時，是指氨基酸序列或核酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)程度，由兩個或更多個氨基酸殘基或核酸殘基的鏈條之間的匹配數(shù)決定?！巴恍浴睖y量兩個或更多個序列中較小序列之間的相同匹配百分比，其中空位比對(如果有的話)由特定數(shù)學模型或計算機程序(即“算法”)解決。相關(guān)氨基酸序列或核酸序列的同一性可以通過已知方法容易地計算。此類方法包括但不限于lesk?a.m.(1988).computational?molecularbiology:sources?and?methods?for?sequence?analysis.new?york,ny:oxforduniversity?press；smith?d.w.(1993).biocomputing:informatics?and?genomeprojects.san?diego,ca:academic?press；griffin?a.m.&griffin?h.g.(1994).computeranalysis?of?sequence?data,part?1.totowa,nj:humana?press；von?heijne?g.(1987).sequence?analysis?in?molecular?biology:treasure?trove?or?trivial?pursuit.sandiego,ca:academic?press；gribskov?m.r.&devereux?j.(1991).sequence?analysisprimer.new?york,ny:stockton?press；carillo?et?al.,1988.siam?j?appl?math.48(5):1073-82中描述的方法。確定同一性的優(yōu)選方法設(shè)計為提供所測序列之間的最大匹配。確定同一性的方法在公開的計算機程序中有描述。確定兩個序列之間同一性的優(yōu)選計算機程序方法包括gcg程序包，包括gap(genetics?computer?group,university?of?wisconsin,madison,wi；devereux?etal.,1984.nucleic?acids?res.12(1pt?1):387-95)、blastp、blastn和fasta(altschul?et?al.,1990.j?mol?biol.215(3):403-10)。blastx程序可從美國國家生物技術(shù)信息中心(ncbi)和其他來源(blast手冊，altschul?et?al.ncb/nlm/nihbethesda,md.20894)公開獲得。公知的smith?waterman算法也可用于確定同一性。

53、“受試者”是指哺乳動物，優(yōu)選人類。受試者可以是“患者”，即溫血動物，更優(yōu)選人類，其正在等待接受醫(yī)療護理或正在接受醫(yī)療護理或曾經(jīng)/現(xiàn)在/將成為醫(yī)療程序的對象，或正在被監(jiān)測疾病的發(fā)展。術(shù)語“哺乳動物”在此是指任何哺乳動物，包括人類、家養(yǎng)和農(nóng)場動物以及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔子等。優(yōu)選地，哺乳動物是靈長類動物，更優(yōu)選人類。

54、“治療”、“緩解”、“治愈”及其任何詞形變化均指治療性治療，不包括預(yù)防性或防止性措施；其目的是減緩、減輕、停止甚至逆轉(zhuǎn)(部分或全部)目標病理狀況或病癥的發(fā)展。需要治療的者包括已患有該病癥的以及疑似患有該病癥的。如果在接受治療后受試者顯示與目標病理狀況或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的可觀察到的和/或可測量的減少或消失；在一定程度上的緩解；發(fā)病率和/或死亡率降低；和/或生活質(zhì)量問題得到改善，則該受試者針對所述病理狀況或病癥被成功“治療”。用于評估疾病的成功治療和改善的上述參數(shù)可以通過醫(yī)生熟悉的常規(guī)程序容易地測量。

55、“預(yù)防”及其任何詞形變化指預(yù)防性或防止性措施，其中目的是減少受試者在給定時間段內(nèi)發(fā)展給定病理狀況或病癥的機率。這種減少可以反映為例如受試者的病理狀況或病癥的至少一種癥狀的延遲發(fā)作。