背景技術(shù)：

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于t細(xì)胞的過繼免疫療法依賴于向患者遞送基因工程t細(xì)胞。這種方法論在過去十年中得到了巨大發(fā)展，從t細(xì)胞擴(kuò)展到其他免疫細(xì)胞，并成為治療一定范圍的惡性腫瘤的最有前途的治療策略之一。

2、本發(fā)明提供多種實體瘤和液體瘤的個性化治療的平臺方法。此外，所述平臺技術(shù)適用于各種腫瘤和靶標(biāo)。具體地，本發(fā)明致力于激活患者的免疫系統(tǒng)以提高或增強(qiáng)針對這些腫瘤和靶標(biāo)的免疫反應(yīng)。

3、本發(fā)明提供在清潔地互相連接的密閉系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞(白細(xì)胞)的修飾。方法包括三個主要步驟：“map?i”：免疫細(xì)胞的(初始)純化，“map?ii”：免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和“mapiii”：重新緩沖轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，以及任選的進(jìn)一步純化。

4、該過程能夠?qū)崿F(xiàn)自動化、密閉式的白細(xì)胞純化(map步驟i)，然后是密閉式、自動執(zhí)行的轉(zhuǎn)染，優(yōu)選地電穿孔，步驟(map步驟ii)以轉(zhuǎn)染純化的自體白細(xì)胞，以及最終的重新緩沖步驟(map步驟iii)。

5、提供免疫細(xì)胞，優(yōu)選地通過白細(xì)胞單采術(shù)或通過處理腫瘤片段，并且消減血小板和紅細(xì)胞等細(xì)胞，并且修飾免疫細(xì)胞，優(yōu)選地通過電穿孔。可以將不同種類的核酸用于電穿孔。將遺傳修飾的細(xì)胞，優(yōu)選地電穿孔的免疫細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至最終配制物中，并接收準(zhǔn)備用于施用的免疫細(xì)胞(“藥品(drug?product)”)。這個過程花費(fèi)約6個小時。

6、細(xì)胞處理系統(tǒng)是密閉容器系統(tǒng)，并且轉(zhuǎn)染，優(yōu)選地電穿孔，系統(tǒng)利用一次性管道組，這些管道組通過免疫細(xì)胞純化裝置管道組與轉(zhuǎn)染裝置管道組和用于最終重新緩沖的管道組的清潔焊接而互相連接。

7、具體地，本發(fā)明提供用于在密閉處理系統(tǒng)中修飾免疫細(xì)胞的體外或離體方法，包括以下步驟：(i)提供來自生物液體和/或來自患者的切除腫瘤的免疫細(xì)胞；(ii)?純化免疫細(xì)胞(map步驟i)；(iii)?用所述免疫細(xì)胞的免疫抑制調(diào)節(jié)劑的抑制性核酸或用免疫增強(qiáng)因子的核酸轉(zhuǎn)染所述純化的免疫細(xì)胞(map步驟ii)；(iv)?純化所述轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞和/或?qū)⑺鲛D(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞重新緩沖至生理溶液中(map步驟iii)；(v)?將所述轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至容器中；

8、其中步驟(i)至(v)的每兩個序貫步驟之間的過渡是在密閉容器系統(tǒng)中和/或其中從一個步驟到另一步驟的過渡發(fā)生在未被打開的容器中。免疫細(xì)胞可以被瞬時修飾。

9、步驟(v)中獲得的轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞可以用作藥物，特別是用于治療癌癥。

10、檢查點(diǎn)抑制劑療法是一種癌癥免疫療法的形式。該療法靶向免疫檢查點(diǎn)，免疫檢查點(diǎn)是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，當(dāng)受到刺激時，可以減弱對免疫刺激的免疫應(yīng)答。一些癌癥可以通過刺激免疫檢查點(diǎn)靶標(biāo)來保護(hù)自己免受攻擊。檢查點(diǎn)療法可以阻斷抑制性檢查點(diǎn)，恢復(fù)免疫系統(tǒng)功能。

11、cbl?(casitas?b系淋巴瘤)蛋白是泛素連接酶家族的一部分，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)泛素化和蛋白質(zhì)底物降解，并且是免疫檢查點(diǎn)抑制劑之一。該家族的成員包含ring型e3連接酶c-cbl、cbl-b和cbl-c。e3泛素連接酶casitas?b系淋巴瘤蛋白-b(cbl-b)是先天性和適應(yīng)性免疫的負(fù)調(diào)節(jié)劑，并且也是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)劑。其限制了大多數(shù)類型的免疫細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞的反應(yīng)性。cbl-b在人cd4+和cd8+?t細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)受到tcr、cd28和ctla-4以及其他共刺激和抑制信號的嚴(yán)格調(diào)控。因此，cbl-b參與腫瘤觸發(fā)的免疫逃避，并被描述為免疫功能中的“主要檢查點(diǎn)”，因為cbl-b抑制同時覆蓋多個相關(guān)的t細(xì)胞抑制途徑，例如通過轉(zhuǎn)化生長因子β，以及通過細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白(ctla-4)和程序性細(xì)胞死亡配體1/程序性細(xì)胞死亡1(pd-l1/pd-1)途徑兩者進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。在免疫細(xì)胞中沉默cbl-b基因后阻斷cbl-b表達(dá)可以增強(qiáng)t細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞的活性，并導(dǎo)致動物模型中腫瘤生長的減少。使用cbl-b沉默的鼠t細(xì)胞的過繼細(xì)胞免疫療法可以顯著抑制同基因小鼠模型中的腫瘤生長。cbl-b沉默的鼠t細(xì)胞與抗pd1具有協(xié)同作用，支持cbl-b沉默的人t細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑(cpi)聯(lián)合的潛在用途。

12、具有至少部分cbl-b抑制的免疫細(xì)胞克服了免疫抑制性腫瘤微環(huán)境(tme)。

13、進(jìn)一步的免疫檢查點(diǎn)抑制劑是shp-1和shp-2。含有src同源性2域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(shp-1)是一種廣泛表達(dá)的抑制性蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)。在t細(xì)胞中，其是抗原依賴性激活和增殖的負(fù)調(diào)節(jié)劑。其是胞質(zhì)蛋白，并因此不適合抗體介導(dǎo)的療法，但其在激活和增殖中的作用使其成為過繼轉(zhuǎn)移策略中基因操縱的有吸引力的靶標(biāo)。

技術(shù)特征：

1.用于修飾免疫細(xì)胞的體外或離體方法，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫細(xì)胞為單個核或多形核免疫細(xì)胞，優(yōu)選地外周血單個核細(xì)胞(pbmc)，特別優(yōu)選地外周血淋巴細(xì)胞(pbl)、自然殺傷(nk)細(xì)胞、t細(xì)胞、b細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或來自實體瘤或來自腫瘤相關(guān)流體的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(til)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述外周血單個核細(xì)胞(pbmc)是通過單采術(shù)從患者獲得的，優(yōu)選地通過單一標(biāo)準(zhǔn)白細(xì)胞單采術(shù)規(guī)程進(jìn)行，并且其中所述腫瘤浸潤細(xì)胞是從加工的腫瘤碎片或從腫瘤相關(guān)液體獲得的。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中在純化所述免疫細(xì)胞之后和/或期間，用ph值為7至8，優(yōu)選地ph值為7.4的緩沖液裂解所述細(xì)胞樣品的紅細(xì)胞，所述緩沖液含有氯離子、銨離子、鉀離子和/或碳酸氫根離子，優(yōu)選地通過使用氯化銨鉀裂解緩沖液，并且/或者消減所述細(xì)胞樣品中的血小板。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中通過所述免疫細(xì)胞的顯微注射、脂質(zhì)體、電穿孔、粒子槍、磁力輔助轉(zhuǎn)染、聲孔效應(yīng)和/或細(xì)胞擠壓技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中轉(zhuǎn)染所述純化的免疫細(xì)胞用至少一種核酸，優(yōu)選地dna、mrna或sirna和/或pna進(jìn)行，這導(dǎo)致一種或多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑、趨化因子受體、細(xì)胞因子和/或嵌合抗原受體的基因表達(dá)模式的修飾。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中轉(zhuǎn)染所述純化的免疫細(xì)胞用用于沉默至少一種免疫檢查點(diǎn)抑制劑的sirna或編碼免疫增強(qiáng)因子的mrna通過電穿孔，優(yōu)選地通過流式電穿孔或通過大體積電穿孔進(jìn)行。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述一種或多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑選自包含以下的組：cbl-b、pd-1、pd-l1、pd-l2、casp、ctla4、foxp3、lag-3、tim-3、tigit、a2ar、kir、btla、vista、b7-h3、b7-h4、ship、shp-1、shp-2、il-1r8、nkg2a、cd96、cd112r、cd160、cd244、ido、irg-1、stat-3、jaks、arg-1、nos-2、cish、tgfb、pka、tnfrsf或其組合。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中重新緩沖所述轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞包括重新緩沖至具有穩(wěn)定劑的生理流體中，優(yōu)選地重新緩沖至含有1%至4%自體人血清的0.9%nacl溶液，優(yōu)選地含有0.7?g/l至4.5?g/l人血清白蛋白的0.9%?nacl溶液中。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中與所述重新緩沖步驟平行地純化免疫細(xì)胞并進(jìn)一步消減血小板和細(xì)胞碎片，優(yōu)選地使用旋轉(zhuǎn)膜技術(shù)、淘析和/或逆流離心。

11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述密閉容器系統(tǒng)包含至少一個容器，優(yōu)選地具有免疫細(xì)胞的袋和/或至少一個緩沖劑容器，和/或連接所述容器的至少一個管道組，和/或至少一個取出端口，優(yōu)選地用于過程中控制；優(yōu)選地，其中所述容器、管道組和/或取出端口是清潔地互相連接的，優(yōu)選地通過使用無菌管道焊機(jī)。

12.免疫細(xì)胞群，其用于治療癌癥的方法中，其中所述免疫細(xì)胞群通過根據(jù)權(quán)利要求1至11中至少任一項所述的方法獲得。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述使用的免疫細(xì)胞群，其中在轉(zhuǎn)染，優(yōu)選地電穿孔之后，所述生物樣品中超過15%的免疫細(xì)胞，優(yōu)選地nk細(xì)胞、t細(xì)胞和b細(xì)胞，含有sirna、mrna或dna。

14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述使用的免疫細(xì)胞群，其中所述免疫細(xì)胞群以至少一個劑量施用，并且一個劑量包含患者的每kg體重5x106至5x1010個，優(yōu)選地5x107至5x108個轉(zhuǎn)染的pbmc或til。

15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項所述使用的免疫細(xì)胞群，其中患者在靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)和/或節(jié)內(nèi)接受免疫細(xì)胞群的單次或多次給藥，優(yōu)選地1至10個劑量，優(yōu)選地3至5個劑量的，并且劑量以2至10周，優(yōu)選地3至7周，最優(yōu)選地4周的間隔施用，持續(xù)至少2個。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供用于在密閉處理系統(tǒng)中瞬時修飾免疫細(xì)胞的體外或離體方法，包括以下步驟：(i)提供來自生物液體和/或來自患者的切除腫瘤的免疫細(xì)胞；(ii)純化免疫細(xì)胞；(iii)用所述免疫細(xì)胞的免疫抑制調(diào)節(jié)劑的抑制性核酸或用免疫增強(qiáng)因子的核酸轉(zhuǎn)染所述純化的免疫細(xì)胞；(iv)將轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞重新緩沖至生理溶液中；(v)將轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至容器中；其中步驟(i)至(v)之間的過渡是在密閉容器系統(tǒng)中；以及使用所述轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞的療法。

技術(shù)研發(fā)人員：A·多納爾,R·古根伯格,B·派鮑爾,H·穆赫利森,S·塞德爾,M·厄本
受保護(hù)的技術(shù)使用者：阿派隆生物制劑股份公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9