本發(fā)明屬于化工領(lǐng)域，涉及一種熒光探針，具體來說，涉及一種熒光探針及其制備方法和在檢測三價鐵離子方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鐵離子因其可能造成嚴(yán)重的嘔吐、腹痛和心臟、肝臟損傷故成為最重要的檢測對象之一。

如果細(xì)胞的鐵穩(wěn)態(tài)受到影響，其氧化還原活性形式會催化產(chǎn)生高活性氧物質(zhì)以引發(fā)對生物大分子和代謝物的損害。根據(jù)epa(美國環(huán)境保護(hù)署)頒布的飲用水標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了鐵離子限量0.3mgl^-1的次要標(biāo)準(zhǔn)。因此，準(zhǔn)確檢測飲用水中fe³⁺離子的含量是必要和重要的。

一些分析方法，如電感耦合等離子體質(zhì)譜(icp-ms)火焰原子吸收光譜(faas)，等等，可以實現(xiàn)檢測鐵離子。然而，這些技術(shù)通常需要耗時的樣品預(yù)處理程序和復(fù)雜的儀器。

與上述技術(shù)相比，用于特定目標(biāo)的具有熒光開關(guān)信號的分子探針提供更有效，更方便，更高的靈敏度和更小的破壞性。通?！按銣纭毙吞结槺取伴_啟”型探針的靈敏度低。與“淬滅”型探針相比，熒光“開啟”探頭是檢測環(huán)境中fe³⁺離子的理想測量工具。

然而，許多現(xiàn)有的fe³⁺離子探針由于fe³⁺的順磁性質(zhì)而基于熒光淬滅機(jī)制。目前，僅有幾種“開啟式”探針已被報道用于選擇性檢測fe³⁺離子。此外，大多數(shù)用于fe³⁺離子檢測的“開啟”探針是溶液型的，并且在水中的溶解性差——疏水性大大限制了其應(yīng)用。

因此，有必要在水溶液中設(shè)計具有高靈敏度和選擇性的測量fe³⁺離子的“開啟”傳感器。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中對fe³⁺檢測耗時長、不方便及靈敏度低的缺陷，提供一種新的開啟型熒光探針，該熒光探針可方便地定量定性檢測fe³⁺，靈敏度高，且合成路線簡便，成本低。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種基于萘酰亞胺的增強(qiáng)型熒光探針，該熒光探針具有如下通式：

其中，r為c1～c9烷基中的任意一種。

較佳地，r為正丁基。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的基于萘酰亞胺的增強(qiáng)型熒光探針的制備方法，該熒光探針的合成路線如下：

，

其包含以下步驟：

步驟1，以n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-溴、哌嗪為原料，反應(yīng)制備n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪；

步驟2，n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪與2,6-二氯甲基吡啶反應(yīng)，制備n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪-2,6-雙(氯甲基)吡啶；

步驟3，n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪-2,6-雙(氯甲基)吡啶與對苯甲醛-哌嗪反應(yīng)制備熒光探針。

較佳地，步驟1中，1,8-萘酰亞胺-4-溴(v)與哌嗪的摩爾比為(2.8-3.2)：(5.8-6.2)，回流反應(yīng)8-10小時。

較佳地，步驟2中，n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪(iii)與2,6-二氯甲基吡啶的摩爾比為(0.4-0.5)：(0.18-0.22)，回流反應(yīng)10-12小時。

較佳地，步驟3中，n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪-2,6-雙(氯甲基)吡啶與對苯甲醛-哌嗪的摩爾比為(0.40-0.44)：(0.44-0.48)，回流反應(yīng)6-8小時。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的基于萘酰亞胺的增強(qiáng)型熒光探針的用途，該熒光探針用于檢測fe³⁺離子的含量。

較佳地，十六烷基三甲基溴化銨作為表面活性劑，幫助熒光探針溶解于水溶液中，用于檢測fe³⁺離子的檢測限為8.05×10^-7m。

較佳地，該熒光探針能定量檢測fe³⁺離子的含量。

較佳地，該熒光探針用于檢測水體、土壤中的fe³⁺離子的含量。

本發(fā)明的熒光探針在檢測溶液中fe³⁺離子的過程中，若溶液中含有fe³⁺離子，通式ⅰ表示的化合物與fe³⁺離子反應(yīng)后生成的具有通式ⅱ結(jié)構(gòu)的化合物，

從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的改變，通過測定反應(yīng)引起的體系中熒光強(qiáng)度的變化獲得fe³⁺離子的濃度。本發(fā)明的熒光探針檢測到fe³⁺離子熒光增強(qiáng)的機(jī)理為“光誘導(dǎo)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理”，稱為“pet(photoinducedelectrontransfer的簡稱)機(jī)理”，通式i發(fā)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移(發(fā)生pet)，熒光發(fā)生“淬滅”；通式ii結(jié)合fe³⁺離子后pet過程被阻斷，熒光增強(qiáng)。

本發(fā)明的熒光探針，可對fe³⁺離子進(jìn)行定性或定量檢測。將本發(fā)明的萘酰亞胺基探針封裝到十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammoniumbromide，ctab)作為水溶性表面活性劑膠束中，增加探針在純水溶液中的相容性，用于在水溶液感測fe³⁺離子。將fe³⁺離子濃度呈梯度變化的水溶液分別加入萘酰亞胺基探針-ctab的水溶液中，反應(yīng)達(dá)到平衡后，分別測定各樣品的熒光強(qiáng)度，然后以fe³⁺離子濃度為橫坐標(biāo)、反應(yīng)后體系的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即可根據(jù)熒光強(qiáng)度從圖中讀出待測溶液中fe³⁺離子的含量。

本發(fā)明的熒光探針可以在水溶液中高選擇性的與fe³⁺離子作用，在fe³⁺離子存在下使得水溶液中熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯增加，即可根據(jù)熒光變化檢測水體中是否存在fe³⁺離子，對于環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

相對于現(xiàn)有的檢測fe³⁺離子的熒光探針而言，本發(fā)明所提供的含萘酰亞胺基熒光探針具有合成比較簡單、合成步驟較少、而且原料成本低廉和易于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，對fe³⁺離子的檢測具有高選擇性和高靈敏性，還能實現(xiàn)定量檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的熒光探針檢測fe³⁺離子的原理示意圖。

圖2是本發(fā)明合成熒光探針naptp高分辨率質(zhì)譜。

圖3是本發(fā)明合成熒光探針naptp核磁共振氫譜。

圖4是本發(fā)明合成熒光探針naptp核磁共振碳譜。

圖5是實施例2中，10μmol·l^-1熒光探針naptp在加入不同濃度fe³⁺離子后熒光發(fā)射光譜圖，從下往上，fe³⁺離子濃度依次為2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90μmol·l^-1，溶液的體系為含有2mmol·l^-1ctab的水溶液，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度值。

圖6是實施例2中，fe³⁺離子的濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，即10μmol·l^-1熒光探針naptp，反應(yīng)后在535nm處熒光強(qiáng)度數(shù)值與fe³⁺離子濃度(2-90μmol·l^-1)的線性關(guān)系；橫坐標(biāo)為fe³⁺離子濃度，縱坐標(biāo)為熒光探針在535nm處熒光強(qiáng)度數(shù)值。

圖7是實施例3中，10μmol·l^-1熒光探針naptp加入了50當(dāng)量的不同金屬離子(以水溶液的形式)后的熒光發(fā)射光譜圖，測試的金屬來自ba²⁺，co²⁺，cu²⁺，zn²⁺，fe²⁺，ag⁺，ni²⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，cr³⁺，k⁺，mn²⁺和na+的相應(yīng)化合物，溶液的體系為含有2mmol·l^-1ctab的水溶液，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度值。

圖8是實施例3中，10μmol·l^-1熒光探針naptp對fe³⁺離子的選擇性示意圖：10μmol·l^-1熒光探針naptp加入了50當(dāng)量的不同金屬離子(以水溶液的形式)后的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度柱形圖，測試的金屬來自ba²⁺，co²⁺，cu²⁺，zn²⁺，fe²⁺，ag⁺，ni²⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，cr³⁺，k⁺，mn²⁺和na+的相應(yīng)化合物，溶液的體系為含有2mmol·l^-1ctab的水溶液，縱坐標(biāo)為535nm處熒光強(qiáng)度。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

本發(fā)明提供的熒光探針具有如下通式：

其中，r取c1～c9烷基中的任意一種。

本發(fā)明的熒光探針的檢測fe³⁺離子的原理如圖1所示，若溶液中含有fe³⁺離子，通式ⅰ表示的化合物(本發(fā)明的熒光探針)與fe³⁺離子反應(yīng)后生成的具有通式ⅱ結(jié)構(gòu)的化合物。

本發(fā)明的熒光探針的合成路線如下：

步驟1，在氮氣氣氛下，n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-溴(v)與哌嗪在乙二醇單甲醚中回流反應(yīng)8-10小時，除去乙二醇單甲醚后，殘余物通過硅膠柱色譜純化，使用氯仿/甲醇(3:1，v/v)作為洗脫劑，得到n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪(ⅲ)；其中，所述的n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-溴(v)、哌嗪及乙二醇單甲醚的摩爾體積比為2.8～3.2mmol：5.8～6.2mmol：15～20ml；

步驟2，將n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪(ⅲ)溶于乙腈中，加入2,6-二氯甲基吡啶，然后在氮氣氣氛下攪拌回流10-12小時后，將混合物冷卻至室溫，減壓蒸餾后得到黃色固體，將其用二氯甲烷/乙酸乙酯(5:1，v/v)作為洗脫劑的硅膠柱色譜純化，得到n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪-2,6-雙(氯甲基)吡啶(ⅳ)；所述的n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪(ⅲ)、乙腈及2,6-二氯甲基吡啶的摩爾體積比為0.4～0.5mmol：45～55ml：0.18～0.22mmol；

步驟3，將n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪-2,6-雙(氯甲基)吡啶(ⅳ)、對苯甲醛-哌嗪和乙腈置于燒瓶中，將混合物回流6-8小時。冷卻至室溫后，減壓蒸餾得到粘稠液體。以二氯甲烷/乙酸乙酯/三乙胺(二氯甲烷/乙酸乙酯＝5/1并加入0.5％三乙胺，均以體積比計)作為洗脫劑的硅膠柱色譜純化，得到相應(yīng)的熒光探針(ⅰ)；所述的n-烷基取代的1,8-萘酰亞胺-4-哌嗪-2,6-雙(氯甲基)吡啶(ⅳ)、對苯甲醛-哌嗪及乙腈的摩爾體積比為0.40～0.44mmol：0.44～0.48mmol：18～22ml。

下面，以r取正丁基為例具體說明本發(fā)明的探針的制備方法及應(yīng)用。

下列實施例中所說的室溫是：25-28℃；所用原料及試劑均為市售品。

實施例1(探針naptp的合成)：

在氮氣氣氛下，ⅴ-1(1.0g，3.0mmol)與哌嗪(0.52g，6.0mmol)在乙二醇單甲醚(15ml)中回流反應(yīng)8小時，除去乙二醇單甲醚后，殘余物通過硅膠柱色譜純化，使用氯仿/甲醇(3:1，v/v)作為洗脫劑，得到ⅲ-1，產(chǎn)率：0.4g(54％)。

將ⅲ-1(163mg，0.44mmol)溶于乙腈(50ml)中，加入2,6-二氯甲基吡啶(35.2mg，0.20mmol)，然后在氮氣氣氛下攪拌回流10小時后，將混合物冷卻至室溫，減壓蒸餾后得到黃色固體，將其用二氯甲烷/乙酸乙酯＝5:1，(v/v)作為洗脫劑的硅膠柱色譜純化，得到ⅳ-1，產(chǎn)率：138mg(82.0％)。

將200mg(0.42mmol)化合物ⅳ-1，87mg(0.46mmol)對苯甲醛-哌嗪和20ml乙腈置于50ml燒瓶中，將混合物回流6小時。冷卻至室溫后，減壓蒸餾得到粘稠液體。以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5：1并加入0.5％三乙胺，經(jīng)過硅膠提純，得到黃色粉末狀的化合物naptp(161mg，61％)。

hrms(esi)計算值c38h42n6o3:631.3397；found:631.3408.[m+h]+，如圖2所示。

¹hnmr(cdcl3,400mhz)δppm:9.80(brs,1h),8.61-8.59(d,1h),8.54-8.52(d,1h),8.44-8.42(d,1h),7.78-7.70(m,4h,ph),7.45-7.40(m,2h,ph),7.25-7.23(d,1h),6.94-6.92(m,2h,ph),4.21-4.17(t,j＝7.60hz,2h,-ch2ch2ch2ch3),3.87(s,2h,-ch2),3.79(s,2h,-ch2),3.48-3.45(t,j＝4.40hz,4h),3.35(m,4h),2.89(m,4h),2.72(m,4h),1.75-1.73(m,2h),1.49-1.44(q,j＝7.60hz,2h),1.01-0.97(t,j＝7.20hz,3h)；如圖3所示。

¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δppm:190.33,164.46,164.01,157.90,157.73,155.90,155.05,136.95,131.81,131.02,130.19,129.88,127.18,126.18,125.59,123.36,121.58,116.84,114.91,113.52,64.37,53.39,53.03,52.88,47.13,40.07,30.26,29.67,20.38,13.83；如圖4所示。

實施例2(探針naptp熒光檢測fe³⁺離子)

將10μmol·l^-1萘酰亞胺基探針(naptp)加入含有0.2mmol·l^-1十六烷基三甲基溴化銨(ctab)的純水溶液中，加入fe³⁺離子，fe³⁺離子濃度依次為2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90μmol·l^-1，激發(fā)波長為390nm，在fe³⁺與naptp-ctab混合三秒鐘后立即發(fā)生熒光增加，熒光光譜如圖5所示，隨著fe³⁺的不斷增加，熒光強(qiáng)度也不斷增加。相對于fe³⁺離子的濃度，naptp-ctab的熒光強(qiáng)度增加是線性的。

反應(yīng)達(dá)到平衡后，以390nm為激發(fā)波長，分別測定各樣品在535nm處的熒光強(qiáng)度，然后以fe³⁺離子濃度為橫坐標(biāo)、反應(yīng)后體系的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖6所示?？梢姡?35nm處的發(fā)射強(qiáng)度與2.0×10^-6m(0.2當(dāng)量)至9.0×10^-5m(9當(dāng)量)范圍內(nèi)的fe³⁺離子濃度之間存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9897。依據(jù)檢測限為空白樣品獲得的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍計算，本方法采用探針naptp熒光檢測fe³⁺離子的檢測限為8.05×10^-7m。

實施例3(探針naptp對fe³⁺離子的選擇性)

通過加入50當(dāng)量的不同金屬離子(以水溶液的形式)，測量了naptp-ctab選擇性。測試的金屬來自ba²⁺，co²⁺，cu²⁺，zn²⁺，fe²⁺，ag⁺，ni²⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，cr³⁺，k⁺，mn²⁺和na+的相應(yīng)化合物。

即使在添加fe³⁺時立即(3秒內(nèi))進(jìn)行naptp-ctab檢測，為了進(jìn)行選擇性研究，在與其他金屬離子作用5.0分鐘后記錄熒光光譜。

該研究證實了探針在選定的金屬離子組中對fe³⁺的高選擇性。如圖7、圖8所示，只有fe³⁺誘導(dǎo)熒光最大值535nm顯著增加，與空白探針相比，fe³⁺的選擇性檢測具有6倍的“開啟”響應(yīng)。除了cd²⁺和hg²⁺之外，其他陽離子在加入每個陽離子后，直到30分鐘后都不會在535nm處發(fā)生任何發(fā)射強(qiáng)度變化。即使cd²⁺和hg²⁺誘導(dǎo)熒光增加，fe³⁺誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度分別比模擬生理條件下hg²⁺和cd²⁺的熒光強(qiáng)度高5.6倍和3.5倍。該結(jié)果表明該系統(tǒng)是非常好的傳感器，可用于識別fe³⁺離子。

實施例4(探針naptp對水體內(nèi)fe³⁺離子的檢測)

以實施例2獲得的圖6為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

將10μmol·l^-1萘酰亞胺基探針加入含有0.2mmol·l^-1十六烷基三甲基溴化銨(ctab)的待測水體中，測出其熒光強(qiáng)度。

從圖6的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中，讀出待測水體中fe³⁺離子的含量，實現(xiàn)定量檢測。

綜上所述，本發(fā)明提供的可用于選擇性檢測fe³⁺離子的熒光探針，由4-哌嗪-萘酰亞胺和4-哌嗪-苯甲醛通過2,6-雙(氯甲基)吡啶連接成的化合物與fe³⁺離子結(jié)合，利用反應(yīng)物和產(chǎn)物之間的熒光差別，可實時高選擇性、高靈敏性地的檢測fe³⁺離子。具體來說，本發(fā)明的熒光探針在390nm激發(fā)，535nm發(fā)射，對fe³⁺離子具有很高的選擇性和靈敏度，在fe³⁺離子與萘酰亞胺基探針-ctab的水溶液混合后三秒鐘立即發(fā)生熒光增加，響應(yīng)速度很快，檢測最低fe³⁺離子濃度達(dá)8.05×10^-7mol·l^-1，靈敏度高，還可定量檢測fe³⁺離子。

盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。