本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用惡臭假單胞菌通過pcr擴增得到腈水解酶基因，構(gòu)建無需體外誘導(dǎo)的組成型重組表達體系，并研究其高密度發(fā)酵工藝及其在煙酸合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙酸(nicotinicacid)，化學(xué)名為3-吡啶甲酸，又可叫尼克丁酸、維生素b3，對人體正常生長發(fā)育具有重要作用，常被應(yīng)用于醫(yī)藥中間體、染料、發(fā)光材料、食品添加劑和動物飼料等生產(chǎn)中。煙酸在機體組織中的氧化還原過程中發(fā)揮重要作用，具有促進細(xì)胞新陳代謝和擴張血管的功能，能夠促進人和動物的生長發(fā)育。煙酸作為藥品可防治皮膚病和類似的維生素缺乏癥，具有擴張血管的作用，用于醫(yī)治末梢神經(jīng)痙攣，動脈硬化等病癥。煙酸還可作為具有生理和化學(xué)活性的精細(xì)中間體、醫(yī)藥中間體，用它可以開發(fā)一系列高附加值的產(chǎn)品，如煙酸鉻、煙酸肌醇酯、ve煙酸酯、2-氯煙酸等。因此對煙酸的研究具有重要的實際應(yīng)用價值。

最初，煙酸是通過氧化尼古丁制得，后來逐漸發(fā)展到以2-甲基-5-乙基吡啶、3-甲基吡啶以及喹啉等為原料制備；在我國，煙酸生產(chǎn)起步于上個世紀(jì)70年代，目前工業(yè)生產(chǎn)中主要以3-甲基吡啶為原料，通過氧化反應(yīng)制備獲得煙酸，而其中氧化方法主要分為液相氧化法和氣相氧化法，以上方法具有氧化劑價格昂貴，過程復(fù)雜，產(chǎn)物難分離，污染高及對生產(chǎn)設(shè)備要求也高等缺點。

相比于傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)煙酸，生物催化法因其反應(yīng)條件溫和，無需在強酸、強堿、高溫、高壓等苛刻的條件下進行，因而倍受關(guān)注。傳統(tǒng)的重組菌產(chǎn)腈水解酶多數(shù)需進行體外誘導(dǎo)，增加了工藝步驟和生產(chǎn)成本，且iptg對菌體具有一定毒害。構(gòu)建無需體外誘導(dǎo)的腈水解酶組成型重組表達體系，可避免iptg使用所導(dǎo)致的生產(chǎn)成本增加及對菌體造成的毒害作用。通過高密度發(fā)酵制備大量菌體用于生物催化反應(yīng)，將進一步降低工藝的生產(chǎn)成本，對于工業(yè)規(guī)模煙酸的生物合成具有重要的研究意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種無需進行體外誘導(dǎo)的腈水解酶組成型重組大腸埃希氏菌escherichiacolinit-1，并研究其高密度發(fā)酵工藝，最終應(yīng)用于煙酸的連續(xù)轉(zhuǎn)化合成。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種產(chǎn)組成型重組腈水解酶的大腸埃希氏菌的構(gòu)建，方法如下：

1)腈水解酶基因nit的擴增：提取惡臭假單胞菌pseudomonasputidacgmcc3830基因組，設(shè)計上下游引物2pu和3bd，pcr擴增獲得腈水解酶基因nit，引物序列如下：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

3bd：5'-attgctcagctcagctctcttcatggaccttaac-3'

2)pet-3b重組質(zhì)粒的制備：利用限制性內(nèi)切酶對pet-3b質(zhì)粒進行雙酶切，將同樣酶切后的腈水解酶基因nit與pet-3b質(zhì)粒相連，得到重組質(zhì)粒pet-3b-nit；

3)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒pet-3b-nit轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)中，得到重組菌e.colibl21(de3)(pet-3b-nit)，命名為大腸埃希氏菌escherichiacolinit-1，現(xiàn)保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路一號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.14254，保藏日期2017年6月19日。

本發(fā)明還提供所述產(chǎn)組成型重組腈水解酶的cgmccno.14254的高密度發(fā)酵方法，具體如下：將斜面菌種進行活化，以2～5％的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的種子培養(yǎng)基中，在30～40℃條件下培養(yǎng)8～16h。按照5～20％接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中，利用ph電極和溶氧電極實時監(jiān)測發(fā)酵液的ph和溶氧值，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，使溶氧維持在10～20％。在分批發(fā)酵階段，流加25％氨水(v/v)使發(fā)酵液ph不低于6.8，分批發(fā)酵階段葡萄糖消耗完后進入補料階段，采用ph-stat補料策略進行發(fā)酵，在補料前期，通過流加氨水的調(diào)控方式設(shè)置ph穩(wěn)定在6.8，每升高0.01即開始流加補料培養(yǎng)基；補料中期，設(shè)置ph每升高0.03即開始流加補料培養(yǎng)基；補料后期設(shè)置每升額高0.05開始補料。發(fā)酵轉(zhuǎn)速維持在600rpm以內(nèi)。所述發(fā)酵罐內(nèi)添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為(g/l)：胰蛋白胨10～20，酵母粉5～15，nacl0.1～1，kcl0.1～0.5，mgcl20.5～1，葡萄糖5～20，微量元素1～5ml/l(微量元素溶液g/l：fecl3·6h2o6，znso4·7h2o0.58，cacl20.2，cucl2·2h2o0.2，mnso4·h2o0.3，edta0.5)，ph6.0～7.0。所述補料培養(yǎng)基組分為(g/l)：葡萄糖500～1000，mgso410～20，微量元素10～20ml/l。

本發(fā)明還提供所述產(chǎn)組成型重組腈水解酶的cgmccno.14254在連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為：以重組大腸埃希氏菌經(jīng)發(fā)酵獲得的菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，在ph7.2的磷酸鹽緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，在30℃條件下進行批次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，采用hplc檢測轉(zhuǎn)化液中底物殘留情況，反應(yīng)完全后，繼續(xù)投入下一批次底物。

所述反應(yīng)體系中底物投料濃度為100～300mm。

所述發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含腈水解酶細(xì)胞用量以菌體干重計為1.5～5.0g/l。

本發(fā)明所述重組菌cgmccno.14254發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含酶濕菌體的菌體干重測量方法為：測量單位菌濁度、單位體積的菌體細(xì)胞干重，得od600與菌體細(xì)胞干重的關(guān)系曲線，可以獲得不同光密度下的菌懸液干重。

本發(fā)明所述檢測底物3-氰基吡啶和產(chǎn)物煙酸的高效液相色譜條件為：dionex3000型高效液相色譜儀，色譜柱為waters公司的xbridgedc18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱溫30℃，流速為0.5ml/min，紫外檢測波長268nm，流動相為乙腈/0.02％三氟乙酸(3/2)等度洗脫。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：(1)本發(fā)明首次成功構(gòu)建了產(chǎn)組成型重組腈水解酶的大腸埃希氏菌cgmccno.14254，該菌株無需進行體外誘導(dǎo)便可高效表達重組腈水解酶，為生物催化合成煙酸提供大量廉價的催化劑；(2)本發(fā)明提供了一種產(chǎn)腈水解酶的大腸埃希氏菌cgmccno.14254的高密度發(fā)酵方法，該方法采用ph-stat策略進行流加補料，既保證了菌體的快速生長，又避免了菌體過快生長產(chǎn)酸所導(dǎo)致的抑制效應(yīng)，而且在不同發(fā)酵階段采用不同的調(diào)控策略，使腈水解酶對3-氰基吡啶底物的酶活達到目前文獻報道的最高水平，為653.84u/ml，菌體最大od600為86.40，分別為分批發(fā)酵的14.87倍和6.69倍；(3)本發(fā)明將重組大腸埃希氏菌用于生物催化生產(chǎn)煙酸實驗，結(jié)果表明，該菌可有效生物催化連續(xù)生產(chǎn)煙酸，底物3-氰基吡啶投料濃度為200mm(20.8g/l)時，以3.51g/l的靜息細(xì)胞為催化劑時，平均轉(zhuǎn)化速率為26.97g/h，能在290min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化22批次底物，煙酸累積濃度可達541g/l，因此該菌株在生物催化連續(xù)生產(chǎn)煙酸的領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為菌體干重與光密度od600之間的關(guān)系曲線；

圖2為ph-stat補料策略下cgmccno.14254產(chǎn)生重組腈水解酶的發(fā)酵過程曲線；

圖3為100mm投料底物濃度對連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸的影響；

圖4為200mm投料底物濃度對連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸的影響；

圖5為300mm投料底物濃度對連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸的影響；

圖6為1.50g/l(a)、2.26g/l(b)、3.51g/l(c)和4.57g/l(d)的cgmccno.14254靜息細(xì)胞進行批次轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。

實施例1：產(chǎn)組成型重組腈水解酶的大腸埃希氏菌cgmccno.14254的構(gòu)建

下列實施例中未注明具體分子構(gòu)建條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人的《分子克隆實驗手冊》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件。

1)腈水解酶基因nit序列的擴增：從惡臭假單胞菌pseudomonasputidacgmcc3830中提取基因組dna，作為模版，設(shè)計上下游引物2pu、3bd及酶切位點，進行pcr擴增，引物：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

3bd：5'-attgctcagctcagctctcttcatggaccttaac-3'

pcr擴增體系：

pcr反應(yīng)過程：在95℃預(yù)變性3min后開始循環(huán)，95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)；于72℃下終延伸5min；12℃保溫獲得攜帶酶切位點的腈水解酶基因nit。

2)重組質(zhì)粒的制備：利用限制性內(nèi)切酶對pet-3b質(zhì)粒進行雙酶切，酶切體系設(shè)計如下：

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析回收獲得酶切后的pet-3b質(zhì)粒。

3)腈水解酶基因與pet-3b質(zhì)粒的連接：連接酶切后的腈水解酶基因與pet-3b質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pet-3b-nit，連接體系設(shè)計如下：

4)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒pet-3b-nit轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)中得到重組菌e.colibl21(de3)(pet-3b-nit)，命名為大腸埃希氏菌escherichiacolinit-1，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.14254，保藏日期2017年6月19日。

實施例2：高密度發(fā)酵技術(shù)在重組腈水解酶發(fā)酵中的應(yīng)用

將斜面菌種cgmccno.14254進行活化，以2％的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的種子培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)8h。按照10％接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中，利用ph電極和溶氧電極實時監(jiān)測發(fā)酵液的ph和溶氧值，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，使溶氧維持在10％。從分批發(fā)酵階段開始，通過流加氨水調(diào)節(jié)ph，使之不低于6.8；在補料階段，設(shè)置ph穩(wěn)定在6.8，(1)補料前期，ph變動0.01時開始流加補料培養(yǎng)基或氨水；(2)補料中期，ph變動0.03開始流加補料培養(yǎng)基或氨水；(3)補料后期，ph變動0.05即開始流加補料培養(yǎng)基或氨水。定期取樣監(jiān)測分批發(fā)酵階段的殘?zhí)菨舛?，?dāng)殘?zhí)腔鞠耐耆珪r進入補料培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)至39h，測得菌體最高od600為86.4，是分批發(fā)酵的6.69倍；在發(fā)酵45h時，酶活達到最高值，為653.84u/ml，是分批發(fā)酵的14.87倍。根據(jù)已有資料來看，本研究所產(chǎn)腈水解酶總酶活為目前文獻報道的最高水平。

實施例3：游離細(xì)胞催化劑的制備及連續(xù)轉(zhuǎn)化

將cgmccno.14254于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10h的發(fā)酵液于12000×g離心1min后棄去上清液，再用磷酸鈉緩沖液(ph7.2,100mm)重懸菌體并洗滌2～3次，得到除去培養(yǎng)基殘液的菌體，最后用相同的磷酸鈉緩沖液重懸菌體得到靜息細(xì)胞懸浮液，測定菌體濃度后保存于4℃冰箱中備用。

將制備的細(xì)胞菌懸液(100ml，菌體干重為2.26g/l)與1.04g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為100mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過hplc檢測轉(zhuǎn)化液中殘留底物情況，當(dāng)?shù)孜锉煌耆D(zhuǎn)化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

當(dāng)投料底物終濃度為100mm時，大腸埃希氏菌游離細(xì)胞能夠在865min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化34批次底物，其中，在前14次補料中，游離細(xì)胞均能夠在20min內(nèi)將底物完全轉(zhuǎn)化，隨著投料反應(yīng)的繼續(xù)以及產(chǎn)物累積濃度的增加，轉(zhuǎn)化時間逐漸延長，至第34次補料，底物轉(zhuǎn)化時間延長至60min，煙酸終濃度達到418g/l。hplc未檢測出任何底物殘留，且反應(yīng)過程無副產(chǎn)物煙酰胺生成，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉(zhuǎn)化速率為10.85g/h。

實施例4：改變投料底物濃度，連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為2.26g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過hplc檢測轉(zhuǎn)化液中殘留底物情況，當(dāng)?shù)孜锉煌耆D(zhuǎn)化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

當(dāng)?shù)孜锿读蠞舛葹?00mm時，轉(zhuǎn)化前期每批次補料的底物均能在20min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，第11批次補料后，底物轉(zhuǎn)化時間延長至25min，在第17批次補料后，底物轉(zhuǎn)化時間延長至60min。最終，游離細(xì)胞能夠在410min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化17批次底物，煙酸終濃度約為418g/l。hplc未檢測出任何底物殘留，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉(zhuǎn)化速率為22.90g/h。

實施例5：改變投料底物濃度，連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為2.26g/l)與3.12g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為300mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過hplc檢測轉(zhuǎn)化液中殘留底物情況，當(dāng)?shù)孜锉煌耆D(zhuǎn)化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

按照3-氰基吡啶終濃度300mm的投料量進行批次轉(zhuǎn)化實驗，重組菌游離細(xì)胞能夠在365min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化8批次底物，在前6次補料中，菌體均能夠在30min內(nèi)將底物完全轉(zhuǎn)化，在第8次投料后，底物完全轉(zhuǎn)化時間延長至115min，煙酸終濃度為295g/l。hplc未檢測出任何底物殘留，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉(zhuǎn)化速率為18.15g/h。

實施例6：改變靜息細(xì)胞濃度，連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為1.50g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過hplc檢測轉(zhuǎn)化液中殘留底物情況，當(dāng)?shù)孜锉煌耆D(zhuǎn)化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

1.50g/l的靜息細(xì)胞能夠在400min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化14批次底物，煙酸濃度達到344g/l，前12批次補料的底物均能在25min內(nèi)被完全轉(zhuǎn)化，直至第14批次補料后，底物在60min左右才被完全轉(zhuǎn)化。單位大腸埃希氏菌菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉(zhuǎn)化速率為29.12g/h。

實施例7：改變靜息細(xì)胞濃度，連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為3.51g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過hplc檢測轉(zhuǎn)化液中殘留底物情況，當(dāng)?shù)孜锉煌耆D(zhuǎn)化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

3.51g/l的靜息細(xì)胞能夠在290min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化22批次底物，煙酸濃度達到541g/l，前20批次補料的底物均能在10min內(nèi)被完全轉(zhuǎn)化，至第22批次補料，底物轉(zhuǎn)化時間延長至60min左右，每克菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉(zhuǎn)化速率為26.97g/h。

實施例8：改變靜息細(xì)胞濃度，連續(xù)轉(zhuǎn)化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為4.57g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過hplc檢測轉(zhuǎn)化液中殘留底物情況，當(dāng)?shù)孜锉煌耆D(zhuǎn)化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

4.57g/l的靜息細(xì)胞可在280min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化24批次的底物，煙酸濃度達到了590g/l，在前22次的投料反應(yīng)當(dāng)中，每批次投入的底物均能在10min內(nèi)被完全消耗，至第24批次補料時，底物轉(zhuǎn)化時間延長到30min。每克菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉(zhuǎn)化速率為23.41g/h。

seqidno:1

composition262a;293c;276g;282t;0other

percentage:23.5%a;26.3%c;24.8%g;25.3%t;0.0%other

molecularweight(kda):ssdna:343.21dsdna:686.18

origin

1tcagctctcttcatggaccttaaccggctcaaattgagcgagcgacttttgtaagaaagg

61accggggacttccaagctatacgttaagccgggtaccgtaccctgcgatattgaggaaaa

121gacttcctccgactcaatatgtttgcccatatccttcagacgtttgacgggagattgggc

181ctggttattgaactgcaatgaaaaaacatcgggccgggaataatggcccacagggtctgc

241agcctgtttagccatcgtgatttgggccagatcgatctcggcgtagaggatcccctctcc

301atccgcaggcagccgctcggctaatggccgaccgtccggtccgaatatttgagcgaatcc

361cccgccatagccgataagctttttgtgcatttcgttttcgcagaaaaactcaagtgcagc

421ttttcccacaacctgagtcgagcacaacacgaaggtttgaccttccattgcgtacatttg

481ggtggcaacaagctgtgcttcggaactgaaggcgaacacttcaggctgatataaggacat

541cccaggccatgccgcgatgtggacctgttcatgtcatcgcgtacatcgcgtatttggttg

601gggtctggaaatgttcccaacagttcaaagcgccgaccctaccaataggcatgtcgtgaa

661ctgcgatgtccgagccatcaccttcgccatagacggtacgctctacatgagtgggtttca

721gctttcgtctgtgagcaacgatcttccctttttcatcaataatcagttggctcatgtaga

781ggctgccgccatcgcgctcactgaatccgatcaccacacatatattattgctctcggcag

841cttcctgaatccgtgtgatcaacgggctgtcaatcgacagggattgttcatgatagcgtg

901tggcgaacttgcccatccccgcgaaggggctatccagccagatgtgatacggatatccgg

961gaataaaaacctcaggaaatgcgatgatctgagcattgttgtcggctgcttcttttatta

1021ggccgatagtttctcgacagtagccgcggcatcaaaccagacgggttcagcttgaaccgt

1081agccgctttgaacttattcgtgtacgtaaccat