本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一株高耐受釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：
：

乙醇是重要的化工原料、有機(jī)溶劑、消毒劑及飲料酒勾兌的原料。隨著地球上化石能源(石油、煤炭、天燃?xì)獾?的日趨枯竭和全球環(huán)境保護(hù)意識的不斷加強(qiáng)乙醇將成為未來主要的可再生能源之一。然而，例如高溫、高滲透壓、高乙醇濃度等脅迫條件都會影響酵母細(xì)胞的生長，進(jìn)而影響乙醇的產(chǎn)量。在濃醪發(fā)酵過程中，溫度過高就需要用冷水降溫，這也會降低乙醇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，提高工業(yè)生產(chǎn)釀酒酵母的高溫耐受性，可以從節(jié)約冷卻水方面提高生物乙醇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。

對于調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞的耐受性，Ras-cAMP信號通路起著關(guān)鍵作用，CYR1基因編碼的腺苷酸環(huán)化酶是該通路的關(guān)鍵酶，催化cAMP的合成。研究發(fā)現(xiàn)，cAMP作為釀酒酵母生理活動的第二信使，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝和壓力抗性方面起著重要的作用。有報道將反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty元件插入到CYR1基因的5’端編碼區(qū)或非編碼區(qū)可以構(gòu)建出具有多種壓力抗性的突變菌株，這樣做會導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶活性減弱(約比野生型菌株低三倍)，這些突變株不但對致死熱激具有抗性，而且對其它的壓力條件如紫外照射，高乙醇濃度等也具有抗性。劉瑩等研究發(fā)現(xiàn)將酵母細(xì)胞的CYR1基因敲除會具有較高的熱抵抗能力。

Ras-cAMP信號通路活性的改變會影響酵母細(xì)胞的耐受性。通過對CYR1基因的表達(dá)調(diào)控，實現(xiàn)酵母細(xì)胞對脅迫環(huán)境的耐受性的改變。改變啟動子強(qiáng)度是實現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控的重要途徑。融合PCR可以實現(xiàn)基因片段的無縫拼接，且不受有限的酶切位點(diǎn)選擇的限制，從而避免了傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建過程中重復(fù)的酶切和連接操作。利用融合PCR和整合型載體質(zhì)粒YIplac211介導(dǎo)的兩步整合方法，在不殘留標(biāo)記基因的前提下，實現(xiàn)對CYR1啟動子3’端序列的不同程度敲除，進(jìn)而構(gòu)建帶有CYR1啟動子強(qiáng)度弱化的釀酒酵母菌株。構(gòu)建的高耐受釀酒酵母菌株可安全用于工業(yè)生產(chǎn)，同時融合PCR介導(dǎo)的兩步整合方法可廣泛應(yīng)用于酵母及其他微生物啟動子調(diào)控，促進(jìn)了基因精確修飾的發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一株高耐受釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的高耐受釀酒酵母菌株是對高溫和乙醇具有一定耐受性的酵母菌株。獲得高耐受釀酒酵母菌株的出發(fā)酵母菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，保存于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，公眾可購買獲得。

所述高耐受釀酒酵母菌株在正常的生長性能不受影響的情況下，對55℃熱擊以及8％(v/v)乙醇都有一定的耐受性，并且在40℃玉米原料高溫濃醪發(fā)酵中乙醇產(chǎn)量相對親本菌株提高了14.6％。

所述高耐受釀酒酵母菌株具體可以通過對出發(fā)菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315的腺苷酸環(huán)化酶編碼基因CYR1啟動子的-150bp至-30bp(ATG＝+1)這一序列無痕敲除來實現(xiàn)。

上述基因無痕敲除可以用以下方法實現(xiàn)。各步驟所涉及具體操作方法參考現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995。

用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到釀酒酵母出發(fā)菌株，通過同源重組實現(xiàn)出發(fā)菌株的URA3基因突變；用PCR方法分別擴(kuò)增靶序列上游和下游長度約為1.2kb的同源序列片段，然后通過融合PCR，將上、下游序列融合成無縫片段；將該片段克隆至酵母整合質(zhì)粒YIplac211上，獲得能夠進(jìn)行整合敲除的質(zhì)粒；在整合敲除質(zhì)粒的上游同源臂或者下游同源臂中，選擇合適的單一酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒酶切線性化；通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將線性化的整合敲除質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培養(yǎng)基篩選發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株；將經(jīng)過鑒定的發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株，經(jīng)含有5-氟乳清酸合成培養(yǎng)基平板反向篩選獲得發(fā)生第二步整合重組的酵母突變株；用PCR方法獲得出發(fā)菌株正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到發(fā)生了二步整合重組的酵母突變株中，以回復(fù)突變的ura3標(biāo)記基因。

本發(fā)明所述釀酒酵母菌株可應(yīng)用于生物燃料乙醇生產(chǎn)中。

有益效果：

1、本發(fā)明提供一種高耐受的釀酒酵母菌株，克服了普通釀酒酵母在脅迫條件下生長不好的問題。

2、本發(fā)明提供的高耐受的釀酒酵母菌株是在保持優(yōu)良發(fā)酵性能的前提下，腺苷酸環(huán)化酶的編碼基因CYR1的表達(dá)量有一定程度的降低，進(jìn)而降低了酵母細(xì)胞的Ras-cAMP信號通路的活性，使得酵母細(xì)胞的耐受性發(fā)生變化，為生物燃料乙醇的生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，而且具有重要的市場價值。

3、本發(fā)明所使用的靶序列敲除方法，避免了酵母傳統(tǒng)敲除過程中篩選標(biāo)記殘留的問題，滿足自克隆的條件，可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)。并且本方法在基因精確修飾方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1為AY15aΔU的表型驗證；

圖2為重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖；

圖3為重組質(zhì)粒的酶切驗證圖：

泳道M為DNA maker；1：SalI和BamHI雙酶切載體質(zhì)粒YIplac211；2-6：分別是SalI和BamHI雙酶切YIplac211-UD-30、YIplac211-UD-60、YIplac211-UD-90、YIplac211-UD-120、YIplac211-UD-150；

圖4為酵母重組菌株的構(gòu)建流程示意圖；

圖5為發(fā)生第一步整合重組的菌株的電泳驗證圖：

泳道M為DNA maker；1：AY15aΔU為模板；2-6：模板分別為AY15aΔU-U-30、AY15aΔU-U-60、AY15aΔU-U-90、AY15aΔU-U-120、AY15aΔU-U-150，CYR1-U-F和YIp-D-F為驗證引物；7：AY15aΔU為模板；8-13：模板分別為AY15aΔU-U-30、AY15aΔU-U-60、AY15aΔU-U-90、AY15aΔU-U-120、AY15aΔU-U-150，YIp-U-R和CYR1-D-R為驗證引物；

圖6為發(fā)生第二步整合重組的菌株的電泳驗證圖：

泳道M為DNA maker；1：AY15aΔU為模板；2-6：模板分別為AY15aΔU-30、AY15aΔU-60、AY15aΔU-90、AY15aΔU-120和AY15aΔU-150，CYR1P-U和CYR1P-D為驗證引物；

圖7為酵母重組菌株的測序驗證；

圖8為親本菌株和酵母重組菌株的生長曲線：

其中，A：培養(yǎng)溫度為30℃，B：培養(yǎng)溫度為40℃；

圖9為親本菌株和酵母重組菌株的耐受性實驗結(jié)果圖。

具體實施方式：

下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1：CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株的構(gòu)建

本實例所用的出發(fā)菌株CICC32315。所述大腸桿菌DH5a購自Takara公司。所述YPD培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基含2％進(jìn)口瓊脂粉。

根據(jù)Genebank中的酵母基因組數(shù)據(jù)和整合質(zhì)粒序列，設(shè)計了下述引物。

表1本實施例中所用到的引物

注：小寫字母表不酶切位點(diǎn)，下劃線表不融合PCR所用引物的重疊序列。

(1)帶有缺陷ura3基因的釀酒酵母AY15aΔU的構(gòu)建

使用Solarbio公司的酵母基因組提取試劑盒，提取實驗室菌株W303-1a的基因組。利用引物對URA3-F和URA3-R，以W303-1a的基因組為模板，PCR擴(kuò)增菌株W303-1a突變ura3片段。經(jīng)過試劑盒回收以后，將片段通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到親本菌株CICC32315中，通過突變ura3與正常URA3之間的同源重組，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株的URA3基因突變。轉(zhuǎn)化后的菌懸液，涂布于補(bǔ)加了5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶(uracil)酵母合成培養(yǎng)基(SD)平板上，30℃培養(yǎng)48h，獲得帶有缺陷ura3基因的釀酒酵母AY15aΔU。獲得的突變株經(jīng)過表型驗證確定正確，如圖1所示AY15aΔU在酵母合成培養(yǎng)基上不長，在YPD平板上生長良好。

(2)整合敲除質(zhì)粒YIplac211-UD-120的構(gòu)建

首先，以親本菌株CICC32315的基因組為模板，使用引物pCYR1-U-SalI和rCYR1-U-Δ120通過PCR獲得靶序列pCYR1-120左側(cè)1151bp的基因序列，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃40s，53℃1min，72℃80s，30個循環(huán)；72℃10min；同時使用引物pCYR1-D-Δ120和rCYR1-D-BamI擴(kuò)增靶序列右側(cè)1201bp的基因序列，PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94℃40s，53℃1min，72℃80s，30個循環(huán)，72℃10min，分別命名為U-120和D-120。然后，以U-120和D-120的混合物為模板，加入引物pCYR1-U-SalI和rCYR1-U-Δ120進(jìn)行融合PCR，獲得無縫融合片段。經(jīng)過切膠回收(試劑盒)后，分別用SalI和BamHI雙酶切，最后亞克隆到整合質(zhì)粒YIplac211的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，整合敲除質(zhì)粒YIplac211-UD-120構(gòu)建成功，缺失序列大小為120bp，構(gòu)建流程如圖2所示。為了確定最優(yōu)的CYR1啟動子強(qiáng)度，用同樣的質(zhì)粒構(gòu)建方法構(gòu)建了其他四種重組質(zhì)粒，，分別為YIplac211-UD-30(缺失序列大小為30bp)、YIplac211-UD-60(缺失序列大小為60bp)、YIplac211-UD-90(缺失序列大小為90bp)、YIplac211-UD-150(缺失序列大小為150bp)，將這五種質(zhì)粒統(tǒng)稱為YIplac211-UD*。圖3為重組質(zhì)粒YIplac211-UD*的酶切驗證圖。

上述融合PCR法為本領(lǐng)域公知的采用具有互補(bǔ)末端的引物，形成具有重疊序列PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊序列延伸，從而將任意DNA片段連接起來的方法，此技術(shù)不需要內(nèi)切酶的消化和連接酶的處理，就可實現(xiàn)DNA片段的體外連接，這使得整合質(zhì)粒經(jīng)過兩步整合重組后，酵母基因組不會殘留外源酶切位點(diǎn)。

(3)CYR1啟動子部分缺失酵母突變株的構(gòu)建

BglII酶切重組質(zhì)粒YIplac211-UD*；用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法將線性化的重組質(zhì)粒YIplac211-UD*導(dǎo)入缺陷型酵母菌株AY15aΔU中，經(jīng)過兩步整合重組后，得到CYR1基因啟動子3’端部分缺失的釀酒酵母，兩步整合重組過程如圖4。

第一步整合重組的發(fā)生，是由于導(dǎo)入的線性化質(zhì)粒與酵母基因組的同源部分發(fā)生整合，從而將整個質(zhì)粒帶入基因組。轉(zhuǎn)化后的菌懸液，涂布于不含尿嘧啶的酵母合成培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)48h，獲得發(fā)生第一步整合重組的酵母菌株，分別命名為AY15aΔU-U-30、AY15aΔU-U-60、AY15aΔU-U-90、AY15aΔU-U-120和AY15aΔU-U-150，這5株菌統(tǒng)稱為AY15aΔU-U*。采用CYR1-U-F和YIp-D-F，YIp-U-R和CYR1-D-R為驗證引物，進(jìn)行PCR驗證篩選。當(dāng)使用引物對CYR1-U-F和YIp-D-F進(jìn)行PCR驗證時，因為下游引物YIp-D-F的退火序列在YIplac211載體質(zhì)粒上，所以酵母菌株AY15aΔU無特異性條帶，而一步整合重組菌株AY15aΔU-U*應(yīng)有一條大小為1800bp左右的條帶；當(dāng)使用引物對YIp-U-R和CYR1-D-R進(jìn)行PCR驗證時，因為上游引物YIp-U-R的退火序列在YIplac211載體質(zhì)粒上，所以酵母菌株AY15aΔU無特異性條帶，而一步整合重組菌株AY15aΔU-U*應(yīng)有一條大小為3000bp左右條帶。PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。轉(zhuǎn)化子與對照比較結(jié)果顯示，線性化的質(zhì)粒整合到目的位點(diǎn)。

經(jīng)過篩選和鑒定的一步整合重組酵母菌株AY15aΔU-U*，取一環(huán)接到5ml液體YPD培養(yǎng)基中，30℃下200rpm振蕩12h后，稀釋10倍涂布于含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的酵母合成培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)48h，獲得發(fā)生第二步整合重組的酵母菌株，第二步整合重組后，出現(xiàn)兩種結(jié)果：一，如果上游同源序列(U)形成的重復(fù)序列之間發(fā)生整合，則酵母回復(fù)成出發(fā)菌株AY15a；二，如果下游同源序列(D)形成的重復(fù)序列之間整合，則中間的所有序列彈出，實現(xiàn)啟動子的精確敲除，同時靶位置上不引入任何外源基因。挑選所得到的單菌落，采用引物對CYR1P-U和CYR1P-D，進(jìn)行PCR驗證，PCR產(chǎn)物條帶大小應(yīng)該分別為366bp、336bp、306bp、276bp、246bp和216bp。篩選出啟動子靶序列部分得到精確敲除的轉(zhuǎn)化子，分別命名為AY15aΔU-30、AY15aΔU-60、AY15aΔU-90、AY15aΔU-120和AY15aΔU-150。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖6。轉(zhuǎn)化子與對照比較結(jié)果顯示，CYR1的啟動子部分得到不同程度的敲除。

(4)二步重組釀酒酵母菌株突變ura3基因的回復(fù)

同本實例中(1)所述的方法，利用引物對URA3-F和URA3-R，擴(kuò)增AY15a正常URA3基因片段，通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化，以回復(fù)二步重組酵母菌株突變的ura3基因，最終構(gòu)建出不殘留任何外源基因序列的無痕敲除菌株，分別命名為AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150。

分別提取二步整合重組酵母菌株的基因組，使用引物對CYR1P-F和CYR1P-R進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)華大基因公司測序，測序結(jié)果與NCBI公布序列比對，驗證結(jié)果如圖7。從圖7可以看出了AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150的CYR1的啟動子缺失情況分別為30bp、60bp、90bp、120bp、150bp。

實施例2：CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株生長性能測定及耐受性實驗

(1)CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株的生長性能測定

測定親本菌株CICC32315及其轉(zhuǎn)化子AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150在30℃和40℃條件下的生長性能，結(jié)果如圖8。結(jié)果顯示，對CYR1啟動子的部分敲除在沒有明顯影響酵母在30℃的生長性能的前提下，40℃下的酵母細(xì)胞的生長性能都得到了一定程度的提高。

(2)CYR1啟動子部分缺失釀酒酵母菌株的耐受性實驗

利用稀釋點(diǎn)板實驗測定親本菌株CICC32315及其轉(zhuǎn)化子AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120、AY15a-150的耐受性變化。

培養(yǎng)條件：

一級：取一環(huán)菌泥接于5mLYPD液體中，30℃，180rpm，培養(yǎng)12h。

二級：取200μL一級菌液接于5mLYPD液體中，30℃，180rpm，培養(yǎng)6-8h至酵母細(xì)胞的對數(shù)期。

調(diào)節(jié)對數(shù)期的酵母細(xì)胞的OD₆₀₀＝1.2，用于做耐受性實驗。對單倍體親本及其轉(zhuǎn)化子各取200μL用于熱擊實驗，55℃熱擊3min，并且稀釋至10^-4，然后從不同稀釋度各取3μL未做熱擊實驗的菌液和做熱擊實驗菌液分別點(diǎn)接于YPD平板上；再從不同稀釋度各取3μL未做熱擊實驗的菌液分別點(diǎn)接于含有260g/L葡萄糖或者8％(v/v)乙醇的YPD平板上，30℃培養(yǎng)3天，拍照。結(jié)果如圖9。結(jié)果顯示AY15a-90和AY15a-120不但表現(xiàn)出很好的耐熱性能，而且對8％(v/v)乙醇的耐受性也有一定程度的提高。

實施案例3：菌株AY15a-90和AY15a-120玉米原料濃醪發(fā)酵實驗

(1)AY15a-90和AY15a-120與親本菌株的玉米原料濃醪發(fā)酵實驗

將親本菌株CICC32315及轉(zhuǎn)化子AY15a-90和AY15a-120分別同時進(jìn)行玉米濃醪發(fā)酵實驗，發(fā)酵工藝路線圖：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷卻→接菌→發(fā)酵→蒸酒→測定指標(biāo)；

工藝條件：

浸泡條件：60～70℃，浸漬20min；液化條件：85～90℃，加入耐高溫α-淀粉酶，液化90min；糖化條件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min；

配料：玉米粉60g，水180mL，耐高溫α-淀粉酶2×10⁵U/mL，30μL，糖化酶200U/mL，90μL，2.5×10³U/mL酸性蛋白酶1.2mL；營養(yǎng)鹽1mL(MgSO₄ 150g/L、KH₂PO₄ 75g/L、尿素81g/L，過濾，4℃保存)；接種量：7.5％，30℃放置12h，再放入40℃，發(fā)酵3天，發(fā)酵結(jié)束后測定各菌株的發(fā)酵性能(CO₂失重、乙醇產(chǎn)量、殘?zhí)?；結(jié)果見表2。

表2菌株發(fā)酵結(jié)果比較

注：所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗的結(jié)果。

表2顯示，在40℃下的高溫濃醪發(fā)酵條件下，轉(zhuǎn)化子AY15a-90和AY15a-120的CO₂失重和乙醇產(chǎn)量都較親本菌株有所提高，AY15a-90和AY15a-120的乙醇產(chǎn)量相對親本菌株分別提高了14.0％和14.6％，說明AY15a-120是優(yōu)于AY15a-90的高耐受釀酒酵母菌株。