專利名稱：白地霉菌株、培養(yǎng)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物催化劑、培養(yǎng)方法及其催化還原酮合成手性醇化合物的用途。
立體選擇性還原酮得到手性醇，可以作為許多具有光學(xué)活性天然產(chǎn)物的合成砌塊和藥物的合成前體。目前，不對(duì)稱還原的方法主要是用化學(xué)方法，如有機(jī)硼試劑或微生物和酶催化還原，盡管已有眾多的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)利用微生物轉(zhuǎn)化法獲得手性醇(如R.Csuk，B.I.Glanger，Chem.Rev 1991，91，49-97；S.Servi，Syntheses，1990，1-25；E.Santaniello，P.Ferraboschi，P.Grisenti，A.Manzocchi，Chem.Rev.1992，92，1071-1140；R.S.Pereira，Critical Reviews in Biotechrology，1998，18，25-83)，但是幾乎都使用啤酒酵母(Baker’s yeast)進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化，雖然啤酒酵母廉價(jià)易得，但是其對(duì)前手性的羰基催化還原時(shí)普遍遵循Prelog規(guī)則，催化還原酮只能獲得一種構(gòu)型的手性醇產(chǎn)物，如R-構(gòu)型，而另外一種構(gòu)型的手性醇卻無法直接獲得。所以，尋找一種具有高還原活力的菌株，可以選擇性地進(jìn)行反-Prelog規(guī)則還原酮獲得與啤酒酵母還原結(jié)果相反的另一種構(gòu)型的手性醇化合物，不僅會(huì)拓展微生物催化合成的方法，而且可直接用于合成手性藥物。
本發(fā)明目的是提供一種具有優(yōu)良還原能力的白地霉新菌株。
本發(fā)明目的還提供一種培養(yǎng)上述菌株的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述菌株的用途，可選擇性地催化還原醇得到S-手性醇化合物。
本發(fā)明提供一種具有優(yōu)良還原能力的菌株白地霉G 702(Geotrichum sp.702)，該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO 0416。該菌株系從泥土中存在的上千種菌株中經(jīng)大量篩選獲得的一株純的菌株，在沙氏斜面上生長(zhǎng)兩天后為乳白色，經(jīng)培養(yǎng)后可用于有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，在顯微鏡下觀察，該菌株呈絲棒狀。
通?？捎孟率龇椒▽?duì)白地霉G 702菌株進(jìn)行培養(yǎng)和接種。用接種環(huán)挑取白地霉G 702菌體接到沙氏斜面上，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后從沙氏斜面上挑取生長(zhǎng)良好的菌體接到培養(yǎng)液中，室溫下往復(fù)搖床培養(yǎng)1-2天，離心(5,000rpm)30分鐘，菌體用0.8％生理鹽水洗滌，再離心后獲菌體可用于反應(yīng)。
所述的沙氏斜面培養(yǎng)基是由2％葡萄糖、1％酵母膏、1％蛋白棟、2％瓊脂的水溶液組成，呈自然PH值。所述的培養(yǎng)液是10％葡萄糖，1％酵母膏，0.1％尿素的水溶液，呈自然PH值。
本發(fā)明的白地霉G 702菌株具有高還原活力的菌株，可選擇性地還原酮獲得與啤酒酵母還原結(jié)果相反構(gòu)型的S-手性醇產(chǎn)物，得到反-Prelog型的S-構(gòu)型的手性醇化合物。而手性醇化合物是一些重要的生理活性化合物和手性藥物的中間體，例如可通過白地霉G 702將下述酮還原成手性S-構(gòu)型的醇
其中產(chǎn)物13可以轉(zhuǎn)化成有用的合成砌塊14。化合物4和16可用于合成手性藥物d-Sotalol，又稱S-甲磺胺心定，是一種β-阻滯劑。當(dāng)化合物11中X＝-SO2-時(shí)，可用于合成手性藥物和甲砜霉素等。
本發(fā)明的白地霉G702是一株具有極高還原活力的菌株，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度塊，不易變異，而且可以廣泛地催化還原不同類型的含羰基化合物，立體選擇性地得到相應(yīng)的手性醇產(chǎn)物，尤其是這些產(chǎn)物是用包括啤酒酵母在內(nèi)的一般生物還原方法所難以獲得的反-Prelog的選擇性產(chǎn)物，具有工業(yè)化應(yīng)用前景。
通過下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但并不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1 菌體的培養(yǎng)用接種環(huán)挑取白地霉G702菌體接到沙氏斜面上，在沙氏斜面培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天，呈乳白色，然后從沙氏斜面上挑取生長(zhǎng)良好的菌體接到培養(yǎng)液中，30℃下往復(fù)搖床培養(yǎng)2天，離心(5,000rmp)30分鐘，菌體用0.8％生理鹽水洗滌一次，再離心后所獲菌體用于反應(yīng)。顯微鏡下觀察菌體呈絲棒狀。
沙氏斜面培養(yǎng)基(％)葡萄糖2，酵母膏1，蛋白胨1，瓊脂2，自然PH值(PH5.6)。
培養(yǎng)液(％)葡萄糖10，酵母膏1，尿素0.1，自然PH(～PH5.6).
上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)液均在120℃和壓力下滅菌20分鐘。
實(shí)施例2 (S)-對(duì)硝基苯乙二醇的合成取新鮮培養(yǎng)的白地霉G702濕菌體60g，懸浮于1000ml 5％葡萄糖液中，慢慢加入10gα-羥基對(duì)硝基苯乙酮，往復(fù)搖床反應(yīng)(轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分)，TLC跟蹤，1天后反應(yīng)完全。過濾除去菌體，反應(yīng)液用固體氯化鈉飽和后，用乙酸乙酯提取(500ml4)，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，獲(S)-對(duì)硝基苯乙二醇9.5g，產(chǎn)率94％，[α]D2523°(C1.0，CH3OH)，光學(xué)純度100％ee。
實(shí)施例3 化合物4的合成α-鹵代酮1為底物，操作同實(shí)施例2，獲產(chǎn)物4，白色固體，mp.88-89℃，產(chǎn)率80％，87％ee，[α]D2528.1°(C1.1，CH2Cl2)。
IR(KBr)，cm-13400，3230，1620，1335，1140，1080，985。
1H NMR(300MHZ，CD3SOCD3)，δ2.97(S，3H)，3.63(dd，1H，J＝11.0，7.1HZ)，3.73(dd，1H，J＝11.0，4.6HZ)，4.73(dd，1H，J＝7.1，4.6HZ)，5.77(bs，1H)，7.17，7.35(AB，4H，J＝8.5HZ)，9.73(S，1H).
HRMS(C9H12ClNO3S+H)+計(jì)算值250 305，實(shí)測(cè)值250.0320。
實(shí)施例4 化合物8和9的合成用含雜原子的酮7為底物，操作同實(shí)施例2，獲產(chǎn)物8和9，8和9為白色固體，mp 69～71℃，[α]D22-96.2(C2.0，CH3OH)，8和9的比例為83∶17，ee值分別為100％和87％。
IR(KBr)，cm-13350，1640，1450，1090，1050，750。
1HNMR(300MHZ，CDCl3)，δ3.06-3.10(m，2H)，3.53-3.75(m，2H)，3.8(6s，1H)，4.41-4.48(m，1H)，7.50-7.70(m，5H).
MS(％)218(m+，2.7)，126(100)，125(64.4)，78(73.8)，77(33.3)，51(20.4)HRMS，(C9H11ClO2S)+，計(jì)算值218.0168，實(shí)測(cè)值218.0168。
實(shí)施例5 化合物11的合成用X＝-SO2-的底物，操作同上獲化合物11(X＝-SO2-)。產(chǎn)率為92％，ee值為93％。1HNMR(CDCl3，300MHZ)，δ1.23(t，J＝7.1HZ，3H)，3.06(S，3H)，3.5(bs，1H)，4.2(q，2H，J＝7.1HZ)，4.36(d，1H，J＝7.9HZ)，5.20(d，1H，J＝7.9HZ)，7.6，7.9(AB，4H，J＝8.4HZ).MS(％)306(m+，10.92)，255(87.2)，217(69.30)，213(73.05)，185(93.72)，122(100)，94(79.63)，79(52.66)，77(55.31).IR(Kbr)，cm-13350，1710，1640，1350，1100，870.
實(shí)施例6 環(huán)狀雙酮12的還原用環(huán)狀雙酮12作底物，操作同上，獲化合物13，產(chǎn)率88％，[α]D2331℃(C1.1，CHCl3)，ee值96％。1H NMR(300MHZ，CDCl3)，δ1.14(s，3H)，1.67(m，1H)，1.90(m，1H)，2.05(m，2H)，2.40(m，4H)，2.82(bs，1H)，3.79(m，1H)，5.10(m，2H)，5.73(m，1H)。13CNMR(CDCl3，75MHZ)，δ19.61，20.52，28.45，36.60，37.64，54.11，76.41，117.85，133.87，214.19。IR(薄膜)，cm-13450，3100，2950，1710，1645，1460，1070，1000，920。MS(％)168(M+，13.60)，99(82.05)，97(69.80)，93(86.83)，79(65.05)，67(71.87)，69(69.56)，55(85.65)，43(100)。HRMS(C10H16O2)+計(jì)算值168.1150；實(shí)測(cè)值168.1151。
實(shí)施例7 α-羥基酮的還原用α-羥基酮15為底物，操作同上，以75％產(chǎn)率獲化合物16，白色固體，mp.135-136℃，[α]D2012.6(C11，CH3OH)，ee值為100％。1HNMR(300MHZ，CD3COCD3)，δ2.94(S，3H)，3.41(S，2H)，3.52(dd，1H，J＝7.7，11.0HZ)，3.60(dd，1H，J＝4.4，11.0HZ)，4.68(dd，1H，J＝4.4，7.6HZ)，7.28，7.37(AB，4H，J＝8.5HZ)。IR(KBr)，cm-13250，1630，1510，1390，1320，1215，1150，1080，1050，990，765。元素分析(％)計(jì)算值C46.74，H5.67，N6.06，S13.87；實(shí)測(cè)值C46.58，H5.65，N5.95，S14.15。
權(quán)利要求
1.一種白地霉菌株，其特征是由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的編號(hào)為CGMCCNO 0416的白地霉G 702(Geotrichum sp.702)，呈絲棒狀。
2.一種如權(quán)利要求1所述的白地霉G 702菌株的培養(yǎng)方法，其特征是白地霉G702在沙氏斜面上生長(zhǎng)，從沙氏斜面挑取菌體在培養(yǎng)液中室溫下培養(yǎng)1～2天，所述的沙氏斜面上有2％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，2％瓊脂，自然PH值組成的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)液含有10％葡萄糖、1％酵母膏，0.1％尿素，自然PH。
3.一種如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的白地霉G 702在沙氏斜面上生長(zhǎng)1-2天。
4.一種如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的白地霉G 702經(jīng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，菌體用0.8％的氯化鈉溶液洗滌，再離心獲菌體。
5.一種如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的自然PH值為PH5.6。
6.一種如權(quán)利要求1所述的白地霉G702菌株的用途其特征是用于催化還原酮化合物制取手性醇化合物。
7.一種如權(quán)利要求6所述的用途，其特征是所述的手性醇化合物具有S構(gòu)型。
全文摘要
本發(fā)明是一種白地霉G702(Geotrichum sp.702)菌株,系從土壤中篩選出并經(jīng)沙氏斜面上生長(zhǎng)良好的菌體在培養(yǎng)液中培養(yǎng)二天獲得純的菌株。該菌株具有高還原活力,可選擇性還原酮得到S－型手性醇化合物。
文檔編號(hào)C07C29/143GK1258735SQ9912575
公開日2000年7月5日 申請(qǐng)日期1999年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月24日
發(fā)明者魏志亮, 李祖義, 林國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所